细胞自噬(autophagy)是真核生物对胞内物质进行自身降解的重要生物学过程,此过程中损坏的蛋白或不需要的细胞器被双层膜的自噬小泡包裹后送入溶酶体(动物)或液泡(植物和酵母)中进行降解并循环利用。细胞自噬参与多种生理生化反应,包括神经退行性疾病、癌症、饥饿、细菌或病毒感染等,其中病毒感染与自噬关系的研究对于更好的理解宿主与病毒互作机制具有重要的生物学意义。家蚕,作为重要的经济昆虫,由于被长期驯化饲养逃避了自然环境的选择,是研究病毒感染与宿主互作的良好素材。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)属于杆状病毒属,是一类具有囊膜包裹的双链环状DNA病毒。病毒感染宿主的过程中调控宿主多种机制以利于自身增殖复制,同时伴随着各种宿主应激反应的发生。近年来,随着对BmNPV感染机制研究的深入,部分宿主抗性机制得到解析,但是病毒与宿主的互作网络仍然不清楚。本研究利用家蚕与BmNPV这一模型,发现了BmNPV感染能影响家蚕细胞自噬;随后,在细胞和个体水平分别利用过表达和CRISPR/Cas9基因敲除技术,证实了自噬相关基因对病毒感染和复制增殖的影响;最后,通过免疫共沉淀和质谱分析探究了自噬相关基因影响病毒感染的分子机制。通过本研究,可为揭示家蚕细胞自噬与BmNPV感染的互作机制提供实验依据和理论基础。论文取得的主要结果和结论如下:1.BmNPV感染对家蚕细胞自噬的影响本研究通过多种经典的自噬检测方法证实了BmNPV感染可以诱导家蚕卵巢细胞系BmN-SWU1细胞发生自噬。首先通过透射电子显微镜观察到BmNPV感染的细胞中出现大量的双层膜自噬小泡,与饥饿诱导的阳性对照相似,而正常培养的细胞中则几乎不存在这种囊泡结构。通过免疫荧光观察ATG8-GFP(自噬体膜标记蛋白)绿色荧光聚点的情况,发现病毒感染细胞的早期(6h),细胞中ATG8-GFP绿色荧光聚点明显增加,而在感染晚期又逐渐减少;统计结果表明感染早期含有绿色荧光聚点的细胞百分比以及单个细胞中荧光聚点的数目都有明显增加的趋势。免疫印迹检测ATG8向ATG8-PE(具有膜结合能力的ATG8蛋白)的转化在病毒感染早期显著加强;ATG8-PE/Tubulin的灰度计算和倍率分析也显示同样的结果。自噬体的出现并不能表明其最终会与溶酶体融合发生降解而形成完整的自噬流,因此我们进一步检测了自噬流的发生情况。我们构建了ATG8-GFP-RFP双荧光检测系统,共聚焦观察发现病毒感染后的细胞中存在大量只发红光而不发绿光的荧光聚点(即自噬溶酶体),而对照中红色荧光则与绿色荧光完全散在重合。p62蛋白作为目前研究最清楚的选择性自噬受体,其降解也是自噬流发生的典型标志。通过p62蛋白的检测和分析,结果显示在病毒感染早期p62发生显著的降解现象。以上结果表明BmNPV感染确实会诱导家蚕BmN-SWU1细胞发生完整的自噬。2.自噬相关基因对BmNPV感染家蚕细胞的影响自噬相关基因(Autophagy-related genes,Atgs)是一类保守的在自噬通路中起关键作用的基因。通过保守结构域预测和分析,我们发现家蚕中目前鉴定的15个Atgs(Atg1-9、Atg11-14、Atg16和Atg18)基因均具有其保守的自噬基因相关结构域。通过实时荧光定量检测发现所有的自噬相关基因的表达在病毒感染的过程中都出现了明显的波动,其中大部分呈现早期上调而后下降的趋势,与病毒诱导自噬发生的趋势一致。随后通过过表达单个Atg基因检测下游Atg8和Atg12基因的表达情况,发现过表达单个Atg基因可引起下游Atg8和Atg12基因表达量的增加。实时荧光定量PCR检测发现过表达单个Atg基因时病毒ie-1基因(病毒立即早期基因)表达显著上调,而敲除单个Atg基因时病毒ie-1基因则显著下调;进一步筛选部分Atgs基因的过表达和敲除样品,检测发现vp39(病毒晚期基因)和p10(病毒极晚期基因)的表达水平也出现了过表达上调而敲除下调的趋势。以上结果证明单个自噬相关基因的变化即可影响病毒关键基因的表达。通过筛选自噬通路上不同阶段行使功能的自噬相关基因,结合前期结果中对病毒感染影响的显著性以及对自噬本身的影响效果,我们最终选择Atg7、Atg9和Atg13作为后续研究的关键基因。3.自噬相关基因对BmNPV感染家蚕个体的影响为了确定自噬相关基因对病毒感染宿主个体的影响,通过转基因技术获得转基因家蚕并对其感染病毒的情况进行分析。首先,我们构建了转基因载体。通过转基因注射和筛选成功获得三个转基因过表达品系,命名为BmAtg7-OE,BmAtg9-OE和BmAtg13-OE,定量检测表明转基因品系均可显著高量表达靶标基因。另外还获得了sgAtg13-DsRed品系,通过与本实验室先前保存的Cas9-EGFP品系杂交,筛选获得了双光的敲除品系,命名为BmAtg13-KO,提取基因组T克隆测序表明敲除效率高达70%。四龄起大造和转基因品系同时添食10~6病毒粒子,通过致死率统计发现转基因过表达家蚕品系具有显著的较高致死率,而BmAtg13-KO敲除品系则表现出一定的抗性。病毒基因组拷贝数分析和病毒关键基因的表达也呈现出与感染后致死率统计一致的结果。以上结果充分说明自噬相关基因对病毒感染个体的过程具有显著的影响。4.BmAtg13影响BmNPV感染宿主效率的机制研究为了探究自噬相关基因影响病毒感染的分子机制,根据前期研究数据我们将Atg13基因(自噬起始复合物ULK1的重要成员之一)作为进一步机制研究的靶基因。首先我们通过序列比对,保守结构域分子模型预测以及进化树分析确认了Atg13基因的保守性。然后利用免疫共沉淀和质谱分析钓取到ATG13互作候选蛋白,包括家蚕蛋白polyubiquitin、ATG7、Hsp70以及大量核糖体蛋白和病毒蛋白Orf5、Orf10与Bro-B。免疫荧光共定位和免疫共沉淀的验证,确认了ATG13与Bro-B,ATG13与ATG7的互作关系。Bro-B是杆状病毒延迟早期蛋白,具有核酸结合活性,可以影响宿主蛋白的合成而有利于自身的感染。ATG13与Bro-B的互作可能涉及宿主与病毒的相互调控。ATG7是自噬两个类泛素共轭系统的关键修饰酶,对自噬体的成膜和延伸至关重要。ATG13与ATG7的互作可能与ATG13作为自噬上游起始复合物一员调控自噬发生的功能有关。截短分析Bro-B与ATG13的互作结构域,发现ATG13的N端HORMA结构域仅与Bro-B的N端可以发生共定位,而ATG13的C端无结构域序列则与Bro-B的N和C端均可发生共定位。最后通过检测两者的相互调控关系发现BmAtg13处于Bro-B的上游,BmAtg13过表达抑制Bro-B的表达,而敲除则促进Bro-B的表达。上述研究证实了BmAtg13与病毒之间存在的博弈,为深入研究自噬与病毒互作机制提供了理论参考和方向。