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目的调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)是一类具有调节功能的成熟的T细胞亚群,对免疫耐受和免疫平衡的维持发挥着重要作用,在脓毒症感染免疫中的作用也受到了越来越多的关注。Treg表现为免疫无能性和免疫抑制性两大特性,主要通过细胞接触机制和细胞因子分泌方式发挥作用。目前严重脓毒症(sever sepsis)患者临床死亡率高达50%,脓毒症发病机制中超过半数为革兰阴性菌所致。在对革兰阴性菌及其产物的识别中,Toll样受体4(Toll-like receptor4, TLR4)起着关键作用,同时也是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁。鉴于TLR4在脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)信号转导的重要性,而且其本身也为Treg细胞表面的膜分子,那么在脓毒症发病过程中,TLR4是否通过作用于Treg影响了免疫功能紊乱的发生发展呢?本实验通过盲肠结扎穿孔术(Cecel liagtion puncture,CLP)建立脓毒症模型,采用免疫磁珠分离法(magnetic cell sorting,MACS)分离小鼠脾脏的Treg,通过检测脓毒症中Treg细胞的功能变化和凋亡情况,以及TLR4表达的变化规律,分析脓毒症Treg功能变化规律,并初步探讨TLR4与Treg功能变化间的可能联系。方法(1)模型制备：SPF级C57BL/6小鼠随即分为模型(CLP)组及假手术(Sham)组,各20只,模型组行CLP建立脓毒症小鼠模型,检测术后24h、48h、72h存活率情况,并于术后24h检测正常(Normal)组、Sham组和CLP组外周血中细胞因子水平变化情况。(2)采用免疫磁珠法分离获取小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞及CD4+CD25+Treg细胞,并鉴定细胞纯度。(3)分离小鼠CD4+CD25+Treg及CD4+CD25-T细胞,设单纯效应T细胞(effector T cell Teff)对照组,另依CD4+CD25+Treg:Teff细胞比例1：1,分别设置Teff细胞与Sham组、CLP24h组和CLP48h组的Treg共培养,加入抗CD-3、抗CD-28共刺激72h,通过噻唑蓝(thiazolyl blue, MTT)比色分析法分析Treg对Teff增殖的抑制状况。(4) Treg与CD4+CD25-T细胞共培养68h后,分别留取细胞上清,酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunoabsorbent assay, ELISA)法测定细胞因子的分泌情况。(5)免疫磁珠法分离CD4+CD25+Treg,用Annexin-V-FITC及Propidium iodide(PI)标记Treg,流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测Treg的凋亡情况。(6)提取三组Treg的mRNA, SYBR GREEN法检测TLR4及Treg的特异性标志物叉头翼状螺旋转录因子(forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3) mRNA表达情况。(7)分离Sham组、CLP24h组和CLP48h组小鼠Treg,分别Anti-Mouse CD152、 Anti-mouse Foxp3FITC和Anti-mouse TLR4(CD284)抗体标记T淋巴细胞毒性相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen4,CTLA-4)、Foxp3以及TLR4,流式细胞仪检测表达情况。结果(1)术后CLP组小鼠出现一系列符合脓毒症症状的表现,死亡均发生在术后12小时之后,72h死亡率50%,初步建立了稳定的脓毒症小鼠模型；造模后24h呈现出免疫功能的紊乱。(2)经过多次细胞分选实验证实,正常小鼠脾细胞经过MACS两次分选后,Treg细胞纯度可达到92.13%～98.62%,CD4+CD25-T细胞纯度可达88.70%-95.33%,所获得的Treg细胞经台盼蓝检测活性大于96%。(3) CD4+CD25-T细胞活化后表现出增殖反应,与Treg共培养后CD4+CD25-T细胞增殖反应受到抑制,Sham组、CLP24h组和CLP48h组CD4+CD25-T细胞的增殖抑制率分别为37.55%、53.91%、62.40%。(4)与Normal组比较,Sham组、CLP24h组和CLP48h组共培养上清中促炎因子IL-2、IFN-γ明显下降,抗炎因子IL-4、IL-10含量明显增加,差异均具有统计学意义(P<0.05),其中以CLP24h组和CLP48h组变化更为明显(P<0.01),表明脓毒症Treg促使Teff发生由Th1向Th2的漂移。(5)与Sham组相比,CLP后Treg的凋亡明显减少,其中CLP48h组与Sham组比较有显著统计学差异(P<0.05)。(6)与Sham组相比,CLP24h和48h组Foxp3mRNA表达均明显升高(P<0.05或P<0.01),以CLP48h组上升为著(P<0.01)。与Sham组比较,CLP24h和48h组Foxp3的蛋白表达亦明显升高(P<0.05或P<0.01),且CLP48h组上调为著(P<0.01)；同时,CLP24h和48h组CTLA-4在Treg的蛋白表达也明显高于Sham组(P<0.05)。(7)与Sham组相比,CLP24h和48h组TLR4mRNA均明显升高(P<0.05或P<0.01),以CLP48h组上升为著(P<0.01)。与Sham组比较,CLP24h和48h组TLR4蛋白的表达明显升高(P<0.05或P<0.01),且CLP48h组上调为著(P<0.01)。结论(1)应用盲肠结扎穿孔法建立的脓毒症动物模型,稳定、可靠,适合后续的实验研究。(2)采用两步法免疫磁珠分离Treg细胞,所得细胞纯度高,细胞活力无影响,完全可以满足进一步实验的要求。(3)脓毒症时Treg的功能与活性明显增强,鉴于其免疫负向调节作用,提示Treg在脓毒症免疫功能紊乱的发生中发挥了重要作用：①Treg对Teff增殖抑制作用明显增强；②Treg通过抑制促炎细胞因子IL-2、IFN-γ等分泌,促进抗炎细胞因子IL-4、IL-10等分泌,促使Th1/Th2平衡发生Th2偏移；③脓毒症Treg的凋亡明显下降,以凋亡方式清除的Treg数量减少,提示发挥功能活性的Treg的数量增加；④影响和决定Treg发育和功能的关键转录因子Foxp3,以及Treg发挥接触抑制效应的重要膜分子CTLA-4的表达均明显增加；(4)Treg中TLR4的表达变化与决定Treg功能活性的关键转录因子Foxp3表达呈正相关性,提示脓毒症时TLR4可能通过作用于Foxp3,影响了Treg功能活性的发挥,但具体机制需进一步研究探讨。