苯乙醇苷类化合物(PhGs)是一类含酚羟基、苯乙醇苷、糖基组成的糖苷类化合物。常见的苯乙醇苷类化合物有酪醇、羟基酪醇、红景天苷、毛蕊花糖苷、松果菊苷等。药理研究表明,该类化合物具有保护心血管系统、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、肝保护、增强记忆等功效。近年来,因其广泛的药理作用,成为生物研究和医学领域的研究热点,且需求量正逐年增加。本实验通过构建petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3)与petDuet-1-ugt73b6/BL21(DE3)工程菌,在培养过程中,添加前体酪醇,对其羟基化与糖基化,进行苯乙醇苷类化合物的生物转化。实验研究内容与结果如下:(1)PCR扩增hpaB基因,构建hpaB-T克隆质粒。hpaC基因由公司合成,自主构建重组质粒petDuet-1-hpaC。提取测序结果正确的hpaB-T与petDuet-1-hpaC质粒分别进行双酶切、纯化回收、连接、转化等步骤,构建原核表达工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3),通过诱导表达,实验结果,工程菌分别在57.2 KD与18.7 KD处有特异性蛋白条带,与目标蛋白分子量相符。(2)糖基转移酶基因ugt73b6由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,构建工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21(DE3),培养工程菌并诱导表达,将表达产物进行SDS-PAGE分析。实验结果表明,在16℃诱导24 h,样品经SDS-PAGE分析,在52.8 KD左右产生特异性蛋白条带,与目的蛋白分子量大小相符。(3)培养工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3),通过添加外源前体酪醇,进行生物转化。样品通过HPLC与质谱法的鉴定,实验结果表明有目标产物羟基酪醇。(4)培养工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21(DE3),通过添加前体酪醇,实现酪醇到红景天苷的生物转化。(5)共同培养工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3)与工程菌petDuet-1-ugt73b6/BL21(DE3),添加前体酪醇,同时进行羟基化和糖基化,实验实现了酪醇到3,4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷及其同分异构体的生物转化,为进一步糖基化合成毛蕊花糖苷与松果菊苷奠定实验基础。(6)为比较两工程菌对羟基酪醇的转化率,设计相关实验,工程菌hpaB-Pet-28a/BL21(DE3)在诱导温度16℃条件下,转化时间在5 h时,羟基酪醇的生物转化率最高值为70%。工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3)在相同的条件下诱导,转化时间在1/2 h时,羟基酪醇的生物转化率最高值为92%。实验表明,在相同实验条件下,工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3)有利于羟基酪醇的生物转化。(7)为优化工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3)对羟基酪醇生物转化条件,在生物转化时间和诱导温度条件上进行优化。在生物转化时间上发现,随着转化时间的延长,羟基酪醇转化率会增加,但并不是成正比关系,在一定时间范围内有所增加,当增加到最大值便呈现下降趋势。实验表明,工程菌petDuet-1-hpaB-C/BL21(DE3)转化时间在1/2 h时,诱导条件为16℃,转化体系中羟基酪醇的转化率最高值为92%。(8)为提高红景天苷的生物转化效率,构建真核表达体系。构建重组质粒pPIC9K-ugt73b6,重组质粒线性化后,通过电击的方式转化到毕赤酵母GS115感受态细胞中,在4个浓度渐增的遗传霉素(0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL)YPD平板筛选高转化子。挑取高浓度遗传霉素平板上单菌落培养后提取基因组,以基因组为模板进行PCR鉴定,将经鉴定结果正确的重组型酵母工程菌命名为pPIC9K-ugt73b6/GS115。对工程菌进行发酵培养和诱导,样品经SDS-PAGE分析,结果表明,诱导时间为48 h、72 h时有特异蛋白条带,蛋白条带分子量约52.8 KD,与目标产物相符。