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目的通过观察艾灸对混合抗生素诱导的肠道菌群失调幼鼠肠道菌群的调整作用及结肠黏膜免疫屏障的保护作用,阐明艾灸对肠道菌群失调幼鼠结肠黏膜免疫屏障损伤的保护作用机制,以期为临床预防抗生素相关性胃肠道疾病提供依据。方法1.50只健康雄性SPF级Balb/c幼鼠常规饲养1周后,随机抽取10只作为空白组,剩余40只以混合抗生素灌胃制作肠道菌群失调幼鼠模型。2.将40只幼鼠从1～40进行编号,采用随机数字表法将其分为4个组别（即模型组、阳性组、艾灸组及联合组）,各组含10只幼鼠。3.空白组不施加任何干预,其余4组于造模完成1d后干预,模型组每天固定束缚15min,共14d;阳性组用双歧杆菌四联活菌片予0.68g/kg·d,与生理盐水混合,按照所需灌胃体积配比进行配制,共14d;艾灸组予以艾灸“神阙、中脘、关元、天枢”四穴,15min/次,1次/d,共14d;联合组则为在艾灸同时（方法如上所述）,以0.68g/kg双歧杆菌四联活菌片试剂灌胃,联合干预14d。4.干预结束后,先采取幼鼠粪便,用16SrDNA测序法检测肠道菌群多样性;然后用LPS诱导肠道炎症反应,HE染色、甲苯胺蓝染色观察幼鼠结肠黏膜组织形态学特征及肥大细胞的浸润情况;免疫组织化学染色检测结肠组织巨噬细胞的表达;RT-PCR检测结结肠组织炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-αmRNA表达;ELISA法检测粪便清蛋白的表达;WB法检测结肠组织ZO-1及Occludin蛋白水平的含量。结果1.与空白组相比,模型组幼鼠体重减轻、进食及饮水量下降、便溏/便血、毛色粗糙、反应迟钝,DAI评分明显升高（P＜0.05）,HE及甲苯胺蓝染色结果显示结肠组织切片有大量炎性细胞浸润;与模型组相比,阳性组、艾灸组及联合组症状均有所改善,DAI评分下降（P＜0.05）,其中联合组疗效最佳。2.物种注释结果显示,本实验样本量充足,可反映出至少97%的微生物信息。和空白组相比,模型组幼鼠肠道菌群的丰富度指数Chao1、ACE及多样性指数Shannon均降低（P＜0.05）,多样性指数Simpson升高（P＜0.05）;与模型组比较,艾灸组、阳性组、联合组幼鼠肠道菌群的多样性指数Shannon均升高（P＜0.05）,多样性指数Simpson降低（P＜0.05）。PCoA分析显示,空白组与模型组距离分散、边界清晰,提示菌群结构发生变化;阳性组、艾灸组及联合组分布在中间,提示各治疗组均对菌群结果产生影响,向空白组靠近,其中联合组最接近空白组。物种组成成分结果分析,从门水平上来看,与空白组幼鼠相比,模型组幼鼠的变形菌门数量显著增加（P＜0.01）,拟杆菌门和厚壁菌门明显减少（P＜0.01）,疣菌门无明显改变（P＞0.05）。而经过治疗后,与模型组幼鼠相比,三组治疗组变形菌门的丰度都显著降低（P＜0.05）,且拟杆菌门与厚壁菌门都有了大幅度上升（P＜0.05）,虽与空白组有一定差距,但结构组成趋向正常。从属水平来看,与空白组幼鼠相比,模型组幼鼠肠道中的优势菌群为克雷伯氏菌,其余菌属按丰度依次为大肠杆菌、其他菌属、拟杆菌、乳酸菌及AKK菌。与空白组相比,模型组幼鼠肠道内克雷伯氏菌属、大肠杆菌丰度增加（P＜0.01）,拟杆菌属、乳酸杆菌属及其他菌门占比减少（P＜0.05）;治疗后对比模型组幼鼠,三组治疗组克雷伯氏菌及大肠杆菌丰度都降低（P＜0.05）,拟杆菌、其他菌属、乳酸杆菌及AKK菌的丰度升高（P＜0.05）,菌群结构逐渐趋向空白组,即艾灸能够调整肠道菌群属水平结构稳定。3.HE染色示:空白组幼鼠结肠黏膜形态结构清晰可见,各腺体形状完整且上皮细胞排列有序、分布整齐。与空白组比较,模型组幼鼠结肠黏膜损伤严重,腺体消失,基层可见大量堆积的炎性细胞;与模型组比较,阳性组、艾灸组及联合组幼鼠结肠黏膜损伤减轻,腺体变长,能够看见少数的炎性细胞;与艾灸组和阳性组比较,联合组幼鼠结肠黏膜损伤较轻,炎性细胞浸润较少。甲苯胺蓝染色显示:空白组幼鼠结肠黏膜组织内可见明显肥大细胞浸润,而模型组小鼠结肠组织未见明显肥大细胞浸润;各治疗组肥大细胞浸润都比较密集,其中联合组更明显。4.免疫组织化学染色示:模型组仅见个别F4/80标记的巨噬细胞,对比空白组显著减少;而经各治疗组预处理后,阳性组、艾灸组及联合组对比模型组幼鼠结肠黏膜组织内有大量F4/80标记的巨噬细胞的浸润,其中联合组及阳性组优于艾灸组。RT-PCR检测结果示:与空白组比较,模型组幼鼠结肠组织内的炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的表达增加（P＜0.05或P＜0.01）,IL-10的表达减少（P＜0.01）。与模型组比较,阳性组、艾灸组、联合组幼鼠结肠组织炎性因子IL-1β、IL-6,IL-8和TNF-α的含量均明显降低（P＜0.01）,IL-10表达明显升高（P＜0.01）。与阳性组及艾灸组相比,联合组幼鼠组织炎性因子IL-1β、IL-6,IL-8和TNF-α表达降低（P＜0.05或P＜0.01）,IL-10表达与阳性组相比差异无统计学意义,与艾灸组相比有所上升（P＜0.05）。5.ELISA法检测粪便清蛋白的表达结果示:与空白组相比,模型组粪便清蛋白含量显著上升（P＜0.01）,差异具有统计学意义;与模型组相比,阳性组、艾灸组及联合组粪便清蛋白含量均明显下降（P＜0.01）,差异具有统计学意义;与联合组相比,阳性组粪便清蛋白含量差异不具统计学意义（P＞0.05）,艾灸组差异显著（P＜0.01）,具有统计学意义。WB法检测结果示:与空白组比较,模型组幼鼠结肠组织中的Occludin、ZO-1蛋白表达含量明显降低（P＜0.01）;与模型组比较,艾灸组、阳性组和联合组结肠组织中的Occludin、ZO-1蛋白表达含量明显升高（P＜0.05,P＜0.01）;与艾灸组及阳性组比较,联合组幼鼠结肠组织中的Occludin、ZO-1蛋白表达含量显著升高（P＜0.01）。结论1.艾灸可改善抗生素诱导所致“体重减轻、进食及饮水量下降、便溏/便血、毛色粗糙、反应迟钝”等症状,改善结肠黏膜的溃疡面,促进结肠黏膜恢复。2.艾灸可以改善抗生素诱导菌群失调幼鼠肠道菌群结构,提高幼鼠肠道菌群的多样性及丰富度,增加有益菌丰度降低有害菌比例,促进菌群结构稳定。3.艾灸预干预后采用LPS诱导结肠,可以改善结肠的炎症,降低了F4/80标记的巨噬细胞的表达水平及促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α的含量,增加了抑炎因子IL-10的含量,从而保护结肠黏膜。4.艾灸对肠道菌群失调幼鼠产生治疗作用的机制与调节肠道菌群稳定、保护结肠黏膜屏障有关。