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背景与目的原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）以肝细胞癌（HepatocellularCarcinoma，HCC）最多见，占90％以上。HCC为世界第六大常见恶性肿瘤，为癌症第三号杀手，在我国发病率和死亡率均占癌症中的第二位，然而它的致病机制至今为止仍然不完全清楚。因此，阐明HCC的致病机制，寻找新的有效的治疗途径仍然是HCC工作者关注的焦点。HCC和其他肿瘤一样，是一种多基因，多步骤，多阶段的发生过程，发病机制复杂，涉及到众多原癌基因的激活及肿瘤抑制基因的灭活。c-myc原癌基因参与细胞的增殖、分化与凋亡，并且与多种肿瘤发生、发展有关。P14ARF是P53途经中重要细胞周期调节蛋白，它结合并调控c-myc的转录活性功能，阻止细胞高增殖和转化，同时抑制c-myc蛋白诱导的基因表达。ARF-BP1是具有HECT结构域的泛素连接酶，与c-myc、p14ARF功能密切相关，可能对肿瘤的发生发展具有调控作用。RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来发现的一种转录后基因表达调控的方式，是生物进化中的一种保守行为，具有抵抗病毒入侵和维持基因组稳定性等作用。由于RNAi能在哺乳动物细胞中敲低多种基因的表达，为肿瘤的基因治疗开辟了一条新的途径。研究表明，利用RNAi技术特异地抑制癌基因、癌相关基因或突变基因的过度表达，使这些基因保持沉默状态，有望达到抗肿瘤的效果。是否可以利用RNAi技术敲低HCC细胞中活跃的ARF-BP1表达，以达到阻止或减缓HCC细胞生长的目的尚属未知领域；在ARF-BP1基因受干扰之后，HCC中其它基因的表达是否受到影响也未见报道。基于上述考虑，本实验采用逆转录-聚合酶连反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）、免疫组织化学技术对HCC组织及其癌旁肝组织中p14ARF、ARF-BP1、c-myc的表达进行检测；采用脂质体包裹技术将ARF-BP1siRNA转染肝细胞癌HepG2细胞，敲低ARF-BP1基因表达，利用流式细胞仪和四甲基偶氮唑蓝光吸收法等多种方法观察ARF-BP1基因对肝细胞癌HepG2细胞增殖、细胞周期、凋亡及相关基因表达的影响，为阐明HCC的致病机制和防治提供实验基础和理论依据。方法1．采用RT-PCR方法检测52例人肝细胞癌组织及45例相应癌旁组织中p14ARF、ARF-BP1及c-myc mRNA的表达；2．采用免疫组织化学方法检测37例人肝细胞癌组织及癌旁组织中P14ARF、c-Myc蛋白表达；3．采用脂质体LipofectamineTM2000包裹技术将ARF-BP1siRNA作瞬时转染，对肝细胞癌HepG2细胞的ARF-BP1基因进行RNAi；4．采用荧光显微镜和流式细胞仪方法鉴定和检测转染效率；5．采用RT-PCR、免疫细胞化学方法检测干扰前后HepG2细胞ARF-BP1基因的表达改变情况，并检测ARF-BP1受到干扰前后不同时间肝细胞癌HepG2细胞中p14ARF、c-myc、ODC-1、p53、mcl-1 mRNA表达的变化；6．采用四甲基偶氮唑蓝光吸收法（MTT）检测干扰前后肝细胞癌HepG2细胞增殖情况；7．应用流式细胞仪分析对照组和转染组进行细胞周期；8．ARF-BP1siRNA转染肝细胞癌HepG2细胞72小时后，进行AnnexinV-FITC和PI合染细胞，流式细胞仪检测对照组和转染组早期凋亡细胞。9．采用SPSS10．0统计软件进行统计学处理。采用t检验对计量资料进行统计学分析，采用x2检验对计数资料进行统计学分析，用相关与偏相关进行相关分析，检验水准P=0．05。结果1．人肝细胞癌组织RT-PCR方法检测结果显示：ARF-BP1、p14ARF、c-mycmRNA在肝癌组织中的阳性率分别为76．90％、76．90％、75．00％，比癌旁组织的20．00％、11．10％、53．30％明显升高，差异有统计学意义（P<0．01）。2．人肝细胞癌组织免疫组织化学染色结果显示：P14ARF、c-Myc蛋白在HCC中强表达。P14ARF、c-Myc蛋白在HCC组织中表达分别为78．38％、75．68％，明显高于癌旁肝组的13．51％（P<0．01）和51．35％（P<0．05）。3．ARF-BP1siRNA转染效率为84．80％，ARF-BP1siRNA干扰48h后肝细胞癌HepG2细胞中ARF-BP1蛋白表达下降。4．用RT-PCR方法对ARF-BP1siRNA转染肝细胞癌HepG2细胞24h、48h、72h后的ARF-BP1基因mRNA表达水平进行检测，结果显示24h的ARF-BP1基因mRNA表达水平下调最明显，随着时间延长mRNA表达恢复到转染前水平。同时检测p14ARF、c-myc、ODC-1、p53及mcl-1 mRNA表达水平，结果显示，p14ARF、c-myc、ODC-1在干扰后24h mRNA表达分别为0．53±0．17、0．22±0．03、0．13±0．08较干扰前的0．85±0．04、1．18±0．07、1．39±0．11明显下降（P<0．05或P<0．01）；c-myc mRNA在干扰后48h表达为0．75±0．16与干扰前比较有差异（P<0．05）；p53和mcl-1mRNA在干扰后72h表达分别为0．29±0．08、0．23±0．04与干扰前比较有差异（P<0．05）。5．MTT检测结果：ARF-BP1siRNA转染HepG2细胞24小时后细胞增殖能力受抑制，48和72小时后细胞增殖能力明显受抑，抑制率分别为38．00％、56．00％、58．00％。转染组与阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组相比较差异均有显著性（P<0．05或P<0．01）。6．流式细胞仪检测细胞周期的结果：siRNA作用24h、48h后HepG2细胞的周期细胞分布无明显变化，而siRNA作用72h后HepG2细胞的周期细胞分布发生明显变化。转染组G2期细胞均数为33．70±2．12，阴性对照组、脂质体对照组、空白对照组G2期细胞均数分别为17．55±3．04、18．84±1．16、17．25±2．19，转染组G2期细胞增多明显，与对照组比较有显著差异（P<0．01）。7．流式细胞仪检测细胞凋亡的结果：流式细胞仪检测siRNA作用HepG2细胞72h后的细胞凋亡情况，发现空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组、转染组的细胞凋亡率各为1．64±0．12％、3．33±0．66％、3．05±0．73％、27．90±1．40％，转染组的凋亡细胞明显增多，与对照组比较有显著差异。结论1．ARF-BP1、p14ARF、c-myc mRNA及P14ARF、c-Myc蛋白在HCC过表达；这种过表达可能与肝细胞癌发生有关；2．ARF-BP1 mRNA表达与小肝癌相关，可能是肝细胞癌发生的早期事件；p14ARFmRNA表达与大肝癌相关，可能与肝细胞癌发展较密切；3．LipofectamineTM2000脂质体是ARF-BP1 siRNA转染肝细胞癌HepG2细胞合适的载体；4．ARF-BP1 siRNA转染肝细胞癌HepG2细胞能够有效干扰HepG2细胞ARF-BP1 mRNA的表达；5．干扰HepG2细胞ARF-BP1基因可能影响HepG2细胞p14ARF、c-myc、ODC-1、p53及mcl-1 mRNA的表达；6．ARF-BP1siRNA转染肝细胞癌HepG2细胞能够有效干扰HepG2细胞ARF-BP1基因的表达，能够抑制HepG2细胞增殖，阻止HepG2细胞的细胞周期运行，促使HepG2细胞发生凋亡；7．在肝细胞癌中可能存在c-Myc-ARF-BP1-P14ARF负反馈调节通路，ARF-BP1可能是影响p14ARF抑制c-Myc的因素；8．ARF-BP1可能是肝细胞癌发生机制的关键者，有可能成为治疗肝细胞癌的有效靶基因。