反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline)是合成诸多药物的重要的手性化合物,也是胶原蛋白的特异性氨基酸,在医药、生化、食品及美容业等方面具有广泛的作用。尽管可以直接通过一些微生物合成,但是产量很低。目前主要通过酸水解胶原蛋白得到,该方法原料昂贵且反应步骤繁琐,分离过程复杂,生产效率低且对环境不利,存在种种缺点。因此,找到一种绿色有效的方法将有助于羟脯氨酸的工业化生产。脯氨酸-4-羟化酶(P4H)是合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的关键酶,该酶在2-酮戊二酸和亚铁离子存在的情况下,能够将游离态的L-脯氨酸催化为L-羟脯氨酸。相对于脯氨酰-4-羟化酶只能利用多肽而对游离的L-脯氨酸无生物活性的性质,具有很大的应用前景。本课题成功地从Pseudomonasstutzeri(strain A1501)及Bor btellaronchiseptica(strain M0149)克隆得到具有酶学活性的脯氨酸-4-羟化酶基因。调整了密码子的偏好性后,人工合成了来自Dactylosporangiumsp.的该基因。本研究中将得到的不同来源的脯氨酸-4-羟化酶基因在大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中成功表达,并测定相关的酶活,初步通过优化培养基条件提高羟脯氨酸的产量。本研究首次将编码该酶的基因转入直接产L-脯氨酸的谷氨酸棒杆菌中,并获得一定的产量,该方法无需额外添加L-脯氨酸和2-酮戊二酸,可以大大减少生产成本。