筛选产生物荧光物质的红曲菌株以及优化产率的研究

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红曲在中国古代也称丹曲,是以稻米为原料接种红曲菌之后经固态发酵而成。红曲一直被认为是有药用和食用双重作用的产品,现代医学研究表明红曲在治疗消化不良、损伤、高血压方面具有很好的疗效,它对胃和脾有保健作用,同时也是理想的食品着色剂和纯粹的天然食品防腐剂。红曲菌发酵代谢产物复杂,不仅能产生酶、有机酸、脂肪酸和氨基酸等初级代谢产物,还能产生色素、莫纳克林类化合物、γ-氨基丁酸、抗菌素、胆固醇抑制剂、桔霉素、中药成分等许多次级代谢产物,但有关荧光物质的报道较少。本文在对金华及其周边地区收集到的10种红曲米的理化特性进行研究时,发现了两种荧光物质,并对荧光物质进行鉴定,然后从红曲米中筛选高产荧光物质的菌株并鉴定,通过菌株诱变进一步提高产量,最后对固态发酵条件进行优化,研究主要结果如下:  (1)对金华及其周边地区10种红曲米研究发现,10种红曲米理化性质有明显差别,其中感官指标差别不大,不同红曲米含水量不同,样品YKLSZGH含水量最高达11.47%,样品YKLSZ含水量最低为6.40%,而且不同红曲米色价差异较大,最大的样品YWDXZ色价可达781.63U/g,最小的QXFH只有109.38U/g。红曲米洛伐他汀的含量相差很大,从无到有,其中YWDX样品中洛伐他汀含量最高为3.34mg/kg。桔霉素定性分析结果表明不同红曲米中均含有桔霉素。  (2)采用硅胶柱层析和制备液相色谱仪对红曲米中两种荧光物质进行分离纯化,使用高效液相色谱法(HPLC)检测荧光物质纯度,使用高分辨质谱(ESI-HRMS)对两种荧光物质进行分析,两者的分子量为356和384,ESI-MS/MS二级质谱把两者鉴定为monasfluore A(MFA)和monasfluoreB(MFB)。  (3)从金华及其周边10种红曲米中分离得到10株红曲菌株,经固态发酵使用HPLC方法获得一株高产MFA、MFB的菌株WZWZ,该菌发酵制得红曲米中荧光物质产量初测分别为MFA=3.63g/kg和MFB=7.29g/kg。对WZWZ菌株进行外观形态观察,显微观察,ITS基因序列测定与分析,最终将菌株WZWZ鉴定为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。  (4)对高产菌株WZWZ进行UV-LiCl复合诱变,最佳诱变条件是紫外线照射75s,LiCl含量为0.04%诱变效果最好,选取诱变株进行大米固态发酵,获得一株产量提高的突变株WZWZ-24,传代培养后遗传稳定性较稳定,MFA、MFB产量为4.52g/kg、8.38g/kg比出发菌株WZWZ提高了24.40%。  (5)最后为进一步提高MFA、MFB的产量,对WZWZ-24进行了单因素发酵实验,分析比较了他们最佳碳源和氮源利用情况,得出突变株WZWZ-24利用麦芽糖作为额外碳源,酵母膏作为额外氮源时MFA、MFB产量较高,之后以单因素实验结果对突变株WZWZ-24固态发酵条件三个主要影响因素进行了L9(33)正交优化实验,确定最佳发酵条件为pH为5,麦芽糖含量1%,酵母膏含量5%。优化发酵后荧光物质产量可达MFA=5.18g/kg,MFB=10.72g/kg。
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