铁是果树生长发育过程中十分重要的微量元素。由于土壤中的铁多以氧化物的形式存在,植物无法直接进行吸收利用,因此缺铁仍然是限制作物尤其是果树的产量和品质的关键。植物为了抵抗缺铁逆境,进化出两种生存策略。第一种策略存在于所有双子叶植物以及非禾本科单子叶植物,它们可以通过质膜H+-ATPase介导的质子外泌来降低土壤p H,将不溶性铁离子转化为可溶性铁,再通过IRT1（铁调控转运蛋白1）将可溶性铁运输到根中。第二个策略存在于禾本科植物中,禾本科植物通过分泌铁载体来螯合铁,螯合的铁复合物通过特定的运输系统到达根系,被根系所吸收。NAC转录因子在植物非生物胁迫响应中起着重要作用,也有研究表明NAC转录因子参与拟南芥中铁离子的调控,但其调控苹果铁离子吸收利用的分子机制尚不清楚。本研究以苹果植株、苹果愈伤组织、拟南芥等为材料,利用分子生物学和生物化学技术手段,揭示了MdBT2介导的MdNAC1翻译后修饰调控铁离子稳态的分子机制,具体结果如下:1.MdNAC1蛋白N端存在保守的NAC结构域,系统发育分析显示,MdNAC1蛋白与Pb NAC1蛋白的相似性最高。MdNAC1在苹果不同组织中呈组成型表达模式,说明MdNAC1可能参与苹果生长发育的多个过程。采用q RT-PCR检测缺铁处理后MdNAC1的表达,发现当苹果转移到缺铁的液体培养基中时,根中MdNAC1转录水平增加,表明MdNAC1对缺铁敏感。2.亚细胞定位发现MdNAC1定位于细胞核。利用酵母进行MdNAC1蛋白转录活性分析,结果表明,MdNAC1的C端结构域具有自主激活活性。3.质子流出染色显示,缺铁条件下,与野生型相比,MdNAC1过表达苹果愈伤组织的质子流出明显增强,质膜H+-ATPase活性显著增加,说明过表达MdNAC1可以促进苹果愈伤组织中铁的积累。q RT-PCR分析显示,在过表达MdNAC1的苹果植株内,质膜H+-ATPase编码基因Md AHA3和Md AHA12的表达被显著诱导。此外,在转基因苹果愈伤组织中,植物缺铁响应的主要转录调控因子Md FIT和下游基因FRO2的表达也被显著诱导。MdNAC1在拟南芥中异位表达的结果与苹果中相似。以上结果表明,过表达MdNAC1提高了植物对铁饥饿的耐受性。4.酵母双杂交（Y2H）实验发现,负调控铁吸收的转录因子MdBT2与MdNAC1互作。进一步酵母双杂交实验显示,MdBT2的BTB-BACK结构域和MdNAC1的NAC结构域对两种蛋白的相互作用必不可少。体外蛋白降解实验结果显示,MdBT2-OX苹果愈伤组织的蛋白提取液可以加速MdNAC1蛋白的降解,而MdBT2-anti苹果愈伤组织的蛋白提取液提高了MdNAC1蛋白的稳定性。泛素化分析发现,在MdNAC1-GFP/MdBT2-OX愈伤组织中存在一条较强的泛素化条带。此外,在MdNAC1-GFP苹果愈伤组织中过表达和抑制MdBT2发现,与MdBT2-p IR/MdNAC1-GFP相比,MdBT2-TRV/MdNAC1-GFP中MdNAC1蛋白的丰度显著增加。综上表明,MdBT2促进了MdNAC1的泛素化和降解。5.表型分析发现,在铁离子充足时,MdBT2转基因植株与野生型在表型上无明显差异。而在缺铁条件下,转基因植株在新叶中表现出了明显的褪绿表型,铁离子和叶绿素含量均显著低于野生型。这表明MdBT2负调控铁离子吸收。MdNAC1-GFP/MdBT2-OX苹果愈伤组织在铁离子饥饿条件下的质子流出趋势弱于MdNAC1-GFP,但强于野生型愈伤组织。测定质膜H+-ATPase活性和铁含量,发现MdNAC1-GFP/MdBT2-OX苹果愈伤组织及MdNAC1-GFP中H+-ATPase活性及铁含量均高于野生型苹果愈伤组织,结果与表型一致。综上所述,在缺铁条件下,MdBT2通过降解MdNAC1蛋白,对铁的利用起负调控作用。过表达MdNAC1通过激活质膜H+-ATPase,提高铁的吸收利用和叶绿素含量。同时,MdBT2通过26S蛋白酶体途径泛素化降解MdNAC1,负调控MdNAC1的蛋白稳定性。此外,在苹果和拟南芥中过表达MdBT2,表现出对铁吸收利用的抑制作用,并在新叶中表现出褪绿现象。综上,本研究提供了分子和生化证据,表明MdBT2可能通过介导MdNAC1的蛋白稳定性负调控铁离子的吸收利用。