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本文利用双向电泳-质谱技术鉴定筛选了紫龙金作用相关蛋白。结果表明,经紫龙金(生药量3mg/mL,下同)处理后,在人胃癌BGC-823细胞中,有23种蛋白的表达水平明显上升,8种蛋白的表达水平明显降低。对其中的部分蛋白进行了质谱鉴定和分析。研究表明,经紫龙金(3mg/mL)作用后的人胃癌细胞BGC-823中蛋白RKIP的表达水平发生明显上调。 western blotting结果也显示出紫龙金(3mg/mL)作用后的人胃癌细胞BGC-823和前列腺癌细胞PC-3M中RKIP明显上调。
RKIP是一个新的肿瘤转移抑制因子,属于磷脂酰乙醇胺结合蛋白家族,广泛存在于各种生物中,参与了对细胞内MAPK、G蛋白偶联受体和NF-kB等多种信号转导通路的调节作用。已有研究显示,RKIP表达水平与前列腺癌细胞的体外侵袭能力呈负相关。
采用紫龙金(3mg/mL)处理人前列腺癌PC-3M细胞,利用"wound healing"迁移实验、Boyden小室体外迁移和Matrigel侵袭实验探讨了紫龙金对人前列腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响,结果显示,紫龙金(3mg/mL)处理使“伤痕”的愈合速度明显减慢,迁移和侵袭过膜的细胞数明显减少,表明紫龙金(3mg/mL)能显著的抑制前列腺癌细胞PC-3M的体外迁移能力和侵袭能力,提示,紫龙金可能通过上调RKIP的表达抑制肿瘤细胞迁移和侵袭能力。
为了进一步探讨RKIP抑制肿瘤转移的作用机理及其功能,通过设计跨越RKIP基因编码区的引物,以紫龙金(3mg/mL)作用后的人胃癌细胞BGC-823的总RNA为模板,利用RT-PCR方法获得RKIP基因编码区cDNA序列,利用DNA重组技术构建了RKIP的真核表达载体pcDNA3.1(-)-RKIP。利用脂质体转染技术,建立了高表达RKIP基因的PC-3M细胞株。通过半定量RT-PCR.和western blotting鉴定获得过表达RKIP的PC-3M细胞株PC-3M-RKIP11和PC-3M-RKIPl4,和转染空载体pcDNA3.1(-)的PC-3M细胞株PC-3M-Contro16。结果显示高表达RKIP后引起了细胞表型的变化,细胞变得相对短粗,带有细长的“角”的细胞减少。通过MTT法测定生长曲线,发现过表达RKIP对PC-3M的增殖和生长没有明显影响;同时用流式细胞术分析,发现过表达RKIP对PC-3M细胞周期时相也无明显影响。“wound healing"迁移实验和Boyden小室体外迁移实验和Matrigel侵袭实验显示,与对照组PC-3M-Contro16细胞相比,高表达RKIP的PC-3M-RKIP11和PC-3M-RKIP14细胞“伤痕”的愈合速度明显减慢,迁移和侵袭过膜的细胞数明显减少,表明RKIP抑制了PC-3M的体外迁移和侵袭能力,同时也进一步显示出RKIP是紫龙金抑制前列腺癌细胞PC-3M转移作用的靶分子。
Western blotting实验鉴定过表达RKIP对细胞信号传导相关因子的影响,结果表明,Phospho-p90RSK(Thr359/Ser363)水平发生明显下调。为了进一步探讨KRIP在紫龙金抑制肿瘤转移中的作用机制与DG/PKC信号通路,特别是与PKC及其亚类的相关性,示,与对照组:LTC细胞(转染空载体人肺癌细胞系LTEPα-2)相比,在PKCα下调表达的人肺癌细胞LT4(转染反义PKCα载体人肺癌细胞系LTEPa-2)中PKIP mRNA表达水平显著上调,相反,在PKCα上调表达的NLTS细胞(转染正义PKCα载体人胚肺细胞系2BS)中PKIP mRNA表达水平显著低于对照组NLTC细胞(转染空载体人胚肺细胞系2BS)。该实验首次表明PKCα可能通过抑制RKIP的转录抑制RKIP的表达。提示PKC及其亚类可能在转录水平和翻译后修饰水平等多个环节上实现对RKIP的精细调控。同时,结合紫龙金可抑制PKCα表达和活性的已有研究资料,该实验结果提示了紫龙金可能通过抑制PKCα进一步作用于RKlP的水平升高,从而导致肿瘤细胞转移被抑制,这可能是RKIP在紫龙金抑制肿瘤细胞转移作用中的分子机理之一。
为了研究RKIP的细胞定位,构建了表达RKIP-EGFP融合蛋白的真核表达质粒pEGFP-RKIP,经纯化后,转染人胃癌细胞BGC-823和前列腺癌细胞PC-3M。用绿色荧光蛋白GFP作为报告基因显示pEGFP-RKIP在细胞内的定位情况。pEGFP-RKIP在胞质和细胞核中均有表达,并且在细胞核除核仁外具有较强的均匀表达。