在生物技术纯化蛋白质的多个步骤中,二维（2D-LC）及多维液相色谱法（mD-LC）已成为分析化学中复杂体系组分分离和分析的有力工具。本研究从二维色谱的核心——色谱柱入手,选取了几种具有弱阳离子交换（WCX）和疏水相互作用（HIC）混合机理的色谱柱,研究蛋白在其上的色谱行为,通过选择合适的流动相,从而在这两种模式下仅用一种流动相,就有可能完成通常用两根色谱柱和两种流动相才能实现的在线蛋白“二维色谱”分离。全文研究内容包括四部分:文献综述.本章概括的介绍了液相色谱技术分离生物大分子的方法以及研究现状,重点介绍了2D-LC中混合模式色谱柱的研究进展以及重要意义,同时对液相色谱的基本理论——计量置换保留模型、短柱理论和在线缓冲溶液交换的研究方法做了简要阐述。实验方法.对实验中所用仪器试剂、实验原理、方法步骤作了详细说明。蛋白在二维色谱柱TSKgel CM-5PW上的保留行为优化研究.选取TSKgel CM-5PW柱发现该柱在离子交换和疏水两种模式下对蛋白都有很好的保留作用,并且有很高的分辨率。从动力学和热力学两个方面研究了蛋白在色谱柱上迁移过程中的保留规律,拟合出计量置换理论（SDT）中三个线性关系方程。通过对这种双功能色谱柱的分离特点的研究,以及色谱分离条件的优化为2D-LC及mD-LC中色谱柱的选择提供了可能。弱阳离子交换色谱中疏水作用对蛋白保留的影响及应用.选取了四种常用的WCX商品柱,发现在HIC模式下蛋白在这四种WCX商品柱上也有不同程度的保留特征,且洗脱曲线呈现出保留值随盐浓度变化的“U”型。从分子力学角度定性解释了因疏水相互作用力的存在影响了蛋白在WCX色谱柱上洗脱顺序的改变。又运用SDT中的两组线性方程进一步证实了WCX和HIC中蛋白与固定相间相互作用力的性质。选择其中的一种色谱柱PolyCAT A^TM对牛胰腺中的胰岛素进行二维快速分离纯化。