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氧自由基（reactive oxygen species,ROS）包括超氧化阴离子（O2-）,羟自由基（·OH）,过氧化氢（H2O2）等。ROS通常被认为是细胞呼吸链的毒性代谢产物,或病理损伤下由巨噬细胞产生,由于ROS为小分子物质,亦可以由外界环境弥散进入细胞内。ROS一般被认为是对人体有害的。既往的研究认为ROS对角膜上皮有害,角膜上皮细胞在病理条件下由线粒体产生大量ROS,如紫外线照射、屈光手术创伤、眼前段化学伤等异常刺激及损伤均可导致氧化应激的产生,造成细胞功能受损甚至死亡。在眼科其他领域的研究中,ROS被认为是导致白内障、黄斑变性等疾病发生的重要原因。目前尚未有关于ROS参与调控角膜上皮细胞生长以及与生长因子、细胞因子等有丝分裂相关信号通路间互作用的研究报道。本学位论文以人角膜上皮细胞株（human cornealepithelial cell,HCE cell line）及原代培养的兔角膜上皮细胞（rabbit corneal epithelialcell,RCE cell）为研究模型,发现表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）可以刺激角膜上皮细胞产生一过性ROS,并且这种内源性ROS参与调节细胞增殖、粘着、移行及创伤修复等生理功能。我们同时发现,短期、低浓度外源性H2O2刺激对角膜上皮细胞生长及创伤修复具有一定的促进作用。第一部分:内源性ROS的发现及其对细胞增殖、粘着、移行以及创伤修复的影响为探索EGF能否刺激角膜上皮细胞生成内源性ROS,将HCE及RCE细胞隔夜逐步脱血清处理后用ROS特异性荧光染料DCF-DA染色,激光共聚焦显微镜下观察EGF（5ng/ml）能否刺激角膜上皮细胞产生内源性ROS。添加抗氧化剂N-acetylcysteine（NAC,40 mM）组作阴性对照,观察细胞内荧光生成变化。结果发现EGF能刺激HCE细胞在90分钟内产生一过性内源性ROS;而抗氧化剂NAC对照组中EGF对内源性ROS生成的作用被抑制,细胞在90分钟的观察时间内无明显荧光生成。为证明EGF刺激所产生的荧光非转染细胞株造成的伪像,进一步采用原代培养的RCE细胞作为模型进行研究,实验结果同样证实,RCE细胞在5ng/ml EGF的作用下在60分钟内也可以产生一过性内源性ROS,且抗氧化剂NAC及氧自由基清除剂mannitol预处理细胞可以抑制荧光强度的产生,我们在国际上首次证实了角膜上皮细胞在生长因子（EGF）的刺激下可以产生内源性ROS。采用NADPH氧化酶、脂肪氧化酶（LOX）、线粒体等细胞内ROS来源活性酶的特异性抑制剂分别抑制酶活性,探索EGF刺激产生的内源性ROS的来源。结果发现NADPH氧化酶及LOX是表皮生长因子EGF刺激相关的内源性ROS的生成来源,抑制这两者活性后内源性ROS生成明显受到抑制,而线粒体抑制剂则对内源性ROS的产生无明显影响。因此,在此部分实验我们发现了EGF可以刺激角膜上皮细胞生成内源性ROS,并确定了ROS来源为NADPH氧化酶及脂肪氧化酶。采用BrdU检测清除EGF刺激生成的内源性ROS后细胞增殖的改变。与空白对照组相比,5ng/ml EGF促进RCE细胞DNA新合成数量增加28%,HCE细胞DNA新合成数量增加30%。而自由基清除剂mannitol（100 mM）及抗氧化剂NAC（40 mM）预先作用30分钟清除内源性ROS后,5 ng/ml EGF对角膜细胞增殖的促进作用被抑制,以上结果证实角膜上皮细胞在EGF作用下产生的这种内源性参与调控角膜上皮细胞的有丝分裂活动。Western blot技术检测抗氧化剂NAC清除内源性ROS后对丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通道及其上游与细胞存活及增殖相关的AKT、MEK信号通道磷酸化及活化的影响。结果显示:EGF刺激产生的ROS参与调节有丝分裂相关的MAPK等信号通道的活化,清除ROS可以抑制EGF下游信号通路的活化。角膜上皮细胞创伤修复主要包括细胞的增殖、粘着及移行三个主要步骤。根据以上实验结果已知内源性ROS参与调控角膜上皮细胞增殖,接下来我们进一步研究ROS对细胞粘着及移行等方面的作用。传代消化后的悬浮细胞接种于纤维粘连蛋白（作为细胞外基质）预处理的培养皿上,观察并计数细胞接种后5小时内抗氧化剂对细胞粘着发生的影响。重复实验证明,清除内源性ROS后EGF对细胞的促进粘着作用被抑制,内源性ROS参与EGF对细胞粘着的调控。分别采用体外培养的人角膜上皮细胞模型及猪角膜器官培养模型观察NAC预处理后或无NAC作用时EGF对创伤愈合的作用效果。HCE生长融合后人为制作一条水平创伤区域,5 ng/ml EGF作用组HCE细胞在16小时后完成创伤愈合,而NAC+EGF组细胞创伤愈合速度明显减慢,16小时后未能完成修复。采用新鲜猪眼球制作角膜创伤器官培养模型,在中央区角膜制作直径为9mm的上皮缺失区域,Richardson’s染料着色无上皮区,观察48小时内角膜上皮创伤修复情况。结果与HCE细胞株创伤模型相符,40 mM NAC预处理组角膜由于清除了细胞内ROS,上皮修复速度与单纯EGF作用组相比明显下降。以上结果证明,内源性ROS参与调节EGF对角膜上皮移行及创伤修复作用。第二部分:低浓度外源性ROS（H2O2）对细胞增殖、粘着、移行以及创伤修复的影响为研究外源性ROS是否具有与内源性ROS相似的调节细胞生理功能的作用,本部分研究首先采用不同浓度的外源性ROS（过氧化氢,hydrogenperoxide,H2O2）刺激HCE细胞4小时,BrdU检测DNA新合成数量发现10-30μM浓度范围内的H2O2能刺激角膜上皮细胞增殖,其中20μM H2O2促角膜增殖作用最明显,过低（<10μM）或者过高（>40μM）浓度的H2O2对细胞没有促增殖作用,甚至抑制细胞增殖。根据以上研究结果,我们选取20μM H2O2作用于铺设纤维粘连蛋白培养皿中的悬浮细胞,观察细胞接种后5小时内抗氧化剂对细胞粘着发生的影响。实验证明,20μM H2O2作用细胞发生粘着的数量及速度均高于对照组及抗氧化剂组,低浓度H2O2具有与EGF类似的促细胞粘着能力。在细胞移行的研究中,我们按第一部分相同方法制作HCE细胞创伤模型,分别采用10μM、20μM、50μM H2O2作用于创伤细胞,只有20μM H2O2具有促进细胞移行的作用。与对照组相比,10μM及50μM H2O2无明显促细胞移行作用。平行组细胞创伤修复实验显示,抗氧化剂NAC抑制20μM H2O2组细胞的移行及创伤修复能力。猪角膜创伤修复器官培养模型制作方法同前,分对照组、20μM H2O2作用组、NAC+H2O2作用三组实验。48小时培养后发现,20μM H2O2具有与EGF类似的促角膜上皮创伤修复作用,培养结束时角膜上皮修复几乎全部完成,而40 mM抗氧化剂NAC预处理30分钟后,20μM H2O2对创伤修复的促进作用被抑制。基于以上的研究结果及分析讨论,本学位申请人得出以下结论:1.本研究在国际上首次发现表皮生长因子EGF能刺激角膜上皮细胞在短时间内产生一过性内源性ROS。2.与EGF刺激相关的内源性ROS主要来源于NADPH氧化酶及脂肪氧化酶,其产生与线粒体无明显关系。3.EGF刺激产生的内源性ROS参与了EGF下游与促细胞有丝分裂相关的MER、MAPK等信号通路及生存信号通路AKT的活化的的调节。4.内源性ROS参与了角膜上皮细胞增殖、粘着、移行及上皮创伤修复等生理功能的调节。5.低浓度H2O2具有与EGF类似的促细胞增殖、粘着、移行,以及角膜上皮创伤修复能力