论文部分内容阅读
目的：靶向放射性核素治疗，是目前最前沿的肿瘤治疗方式之一。即选用相应配体作为放射性核素的载体，利用受体配体特异性结合的特点，可将目标放射性药物靶向递送至肿瘤组织，从而达到靶向治疗的目的。然而，靶向放射性治疗技术有赖于高亲和力、高特异性的靶向载体的选择。
透明质酸作为一种线性多糖，它能与在多种癌细胞表面过表达的CD44受体特异性结合。与天然HA相比，将其它靶向性组份与HA缀合，则可通过靶向它们的组合以显著提高HA作为载体的特异性。三肽结构Asn-Gly-Arg（NGR）是APN/CD13受体的靶向性配体，后者作为一种恶性细胞表面标志物在众多新生血管丰富的肿瘤细胞表面高度表达。结合透明质酸与NGR这两种靶向性分子有望扩展药物靶向适应症的范围，提高靶向治疗效果。
在本研究中，我们开发了用于靶向恶性肿瘤的多功能HA：177Lu-DOTA/Alexa647-HA100/7-N。将HA作为靶向性载体，将用于提高靶向性的NGR多肽、用于体外/体内跟踪的荧光探针Alexa Fluor647和用于放射性标记的螯合剂mal-DOTA均连接在该材料上，为靶向放射性治疗该新型肿瘤治疗方式提供了研究基础。
方法：1、透明质酸衍生物的制备：首先对透明质酸进行巯基化修饰，再通过迈克尔加成反应，将含有马来酰亚胺基团的Alexa Fluor647和mal-DOTA均连接到透明质酸上，得到透明质酸衍生物，即DOTA/Alexa647-HA100/7。再通过点击化学反应，将透明质酸衍生物与多肽ky-c-NGR进行反应，得到NGR功能化的透明质酸衍生物，即DOTA/Alexa647-HA100/7-N。
2、细胞毒性实验：我们采用MTS法进行细胞毒性实验，分别检测天然透明质酸（HA100/7）、透明质酸衍生物（DOTA/Alexa647-HA100/7）、NGR功能化的透明质酸衍生物（DOTA/Alexa647-HA100/7-N）对多种细胞系的毒性作用。
3、细胞荧光摄取实验：运用倒置荧光显微镜进行细胞荧光摄取定性实验，研究DOTA/Alexa647-HA100/7以及DOTA/Alexa647-HA100/7-N在高表达CD44或CD13的细胞系中的摄取情况。
4、小动物荧光显像实验：选用SPF级别BALB/c雌性裸鼠建立荷瘤鼠模型，探索经荧光标记的目标化合物在A549、NCI-H292荷瘤鼠体内的靶向情况。
5、放射性标记实验：用177LuCl3对DOTA/Alexa647-HA100-N进行放射性标记，得到177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N；通过瞬时硅胶薄层色谱法测定标记产物的放射化学纯度，并检测177Lu-DOTA/Alexa647-HA100/7-N在不同媒介中的体外稳定性。
6、放射性生物分布实验：选用SPF级别BALB/c雌性裸鼠建立荷瘤鼠模型，根据荧光显像结果，选用A549、NCI-H292细胞系建立肿瘤动物模型。通过尾静脉注射177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N至相应荷瘤鼠体内，并于48h处死裸鼠，收集其主要器官和组织进行生物分布实验。
结果：
1、成功制备了荧光/177Lu标记的NGR功能化透明质酸衍生物，并且进行了表征，通过计算得到了相关配体各自的接枝比。
2、细胞毒性实验结果显示，三种样品在0.05-1.5mg/mL的浓度范围内对NCI-H292和HCT-116细胞均没有明显毒性作用。当上述三种样品的浓度达到1.5mg/mL时，细胞A549、HT-1080和MCF-10A的细胞存活率下降到60-80%，与DOTA/Alexa647-HA7孵育的A549细胞存活率也最低，为52.6±37.25%，结果提示我们，改变透明质酸的分子量对细胞的毒性作用的影响可忽略不计。
3、细胞荧光摄取实验结果提示：没有经过NGR功能化修饰的透明质酸衍生物DOTA/Alexa647-HA100/7能被高表达CD44的细胞摄取；经过NGR功能化修饰的透明质酸衍生物DOTA/Alexa647-HA100/7-N不仅能被高表达CD44的细胞摄取，同时也能被高表达CD13的细胞摄取。
4、从小动物荧光显像结果我们发现：标记有荧光探针的DOTA/Alexa647-HA100-N可富集到A549、NCI-H292荷瘤鼠肿瘤组织中，且在肿瘤组织中的滞留时间可达到144h。
5、成功运用177Lu对DOTA/Alexa647-HA100-N进行了放射性标记实验，运用瞬时硅胶薄层色谱法测得其放射化学纯度大于99%，且它具有较好的体外稳定性。
6、生物分布结果提示：目标荷瘤鼠肝脏内177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N的累计%ID/g值分别：NCI-H292为29.67±3.79；A549为28.16±5.51。荷瘤鼠肿瘤组织中177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N的累计%ID/g分别：NCI-H292为1.91±0.97；A549为0.24±0.17。荷瘤鼠肿瘤与血液靶比值分别：NCI-H292为17.36±5.6；A549为2.40±0.12。结果提示：目标放射性药物对NCI-H292荷瘤鼠具有更好的靶向性。表明，与肿瘤新生血管细胞的特异性结合在恶性肿瘤体内靶向的过程中起着重要作用。
结论：本文设计并成功构建了一种NGR功能化修饰的透明质酸衍生物，使用荧光探针Alexa Fluro647对它进行标记实现了对该药物体外/体内的追踪，示踪结果提示该药物可被多种高表达CD44或CD13受体的肿瘤细胞摄取，实现了对CD44、CD13的协同靶向作用。荧光成像证实，DOTA/Alexa647-HA100-N可在CD13表达阳性或具有丰富新生血管形成的肿瘤组织中富集，同时该药物能在肿瘤中持续滞留至144h。此外，我们成功制备了放射性标记的177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N，其放射化学纯度（RCP）超过99%，该放射性化合物在体外模拟的生理条件下能保持良好的稳定性，并且能在NCI-H292荷瘤小鼠的肿瘤部位聚集。NGR功能化透明质酸衍生物的成功构建与它良好的靶向性、标记效率以及较好的体外稳定性为我们今后对肿瘤的靶向放射性治疗提供了研究基础。
透明质酸作为一种线性多糖，它能与在多种癌细胞表面过表达的CD44受体特异性结合。与天然HA相比，将其它靶向性组份与HA缀合，则可通过靶向它们的组合以显著提高HA作为载体的特异性。三肽结构Asn-Gly-Arg（NGR）是APN/CD13受体的靶向性配体，后者作为一种恶性细胞表面标志物在众多新生血管丰富的肿瘤细胞表面高度表达。结合透明质酸与NGR这两种靶向性分子有望扩展药物靶向适应症的范围，提高靶向治疗效果。
在本研究中，我们开发了用于靶向恶性肿瘤的多功能HA：177Lu-DOTA/Alexa647-HA100/7-N。将HA作为靶向性载体，将用于提高靶向性的NGR多肽、用于体外/体内跟踪的荧光探针Alexa Fluor647和用于放射性标记的螯合剂mal-DOTA均连接在该材料上，为靶向放射性治疗该新型肿瘤治疗方式提供了研究基础。
方法：1、透明质酸衍生物的制备：首先对透明质酸进行巯基化修饰，再通过迈克尔加成反应，将含有马来酰亚胺基团的Alexa Fluor647和mal-DOTA均连接到透明质酸上，得到透明质酸衍生物，即DOTA/Alexa647-HA100/7。再通过点击化学反应，将透明质酸衍生物与多肽ky-c-NGR进行反应，得到NGR功能化的透明质酸衍生物，即DOTA/Alexa647-HA100/7-N。
2、细胞毒性实验：我们采用MTS法进行细胞毒性实验，分别检测天然透明质酸（HA100/7）、透明质酸衍生物（DOTA/Alexa647-HA100/7）、NGR功能化的透明质酸衍生物（DOTA/Alexa647-HA100/7-N）对多种细胞系的毒性作用。
3、细胞荧光摄取实验：运用倒置荧光显微镜进行细胞荧光摄取定性实验，研究DOTA/Alexa647-HA100/7以及DOTA/Alexa647-HA100/7-N在高表达CD44或CD13的细胞系中的摄取情况。
4、小动物荧光显像实验：选用SPF级别BALB/c雌性裸鼠建立荷瘤鼠模型，探索经荧光标记的目标化合物在A549、NCI-H292荷瘤鼠体内的靶向情况。
5、放射性标记实验：用177LuCl3对DOTA/Alexa647-HA100-N进行放射性标记，得到177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N；通过瞬时硅胶薄层色谱法测定标记产物的放射化学纯度，并检测177Lu-DOTA/Alexa647-HA100/7-N在不同媒介中的体外稳定性。
6、放射性生物分布实验：选用SPF级别BALB/c雌性裸鼠建立荷瘤鼠模型，根据荧光显像结果，选用A549、NCI-H292细胞系建立肿瘤动物模型。通过尾静脉注射177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N至相应荷瘤鼠体内，并于48h处死裸鼠，收集其主要器官和组织进行生物分布实验。
结果：
1、成功制备了荧光/177Lu标记的NGR功能化透明质酸衍生物，并且进行了表征，通过计算得到了相关配体各自的接枝比。
2、细胞毒性实验结果显示，三种样品在0.05-1.5mg/mL的浓度范围内对NCI-H292和HCT-116细胞均没有明显毒性作用。当上述三种样品的浓度达到1.5mg/mL时，细胞A549、HT-1080和MCF-10A的细胞存活率下降到60-80%，与DOTA/Alexa647-HA7孵育的A549细胞存活率也最低，为52.6±37.25%，结果提示我们，改变透明质酸的分子量对细胞的毒性作用的影响可忽略不计。
3、细胞荧光摄取实验结果提示：没有经过NGR功能化修饰的透明质酸衍生物DOTA/Alexa647-HA100/7能被高表达CD44的细胞摄取；经过NGR功能化修饰的透明质酸衍生物DOTA/Alexa647-HA100/7-N不仅能被高表达CD44的细胞摄取，同时也能被高表达CD13的细胞摄取。
4、从小动物荧光显像结果我们发现：标记有荧光探针的DOTA/Alexa647-HA100-N可富集到A549、NCI-H292荷瘤鼠肿瘤组织中，且在肿瘤组织中的滞留时间可达到144h。
5、成功运用177Lu对DOTA/Alexa647-HA100-N进行了放射性标记实验，运用瞬时硅胶薄层色谱法测得其放射化学纯度大于99%，且它具有较好的体外稳定性。
6、生物分布结果提示：目标荷瘤鼠肝脏内177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N的累计%ID/g值分别：NCI-H292为29.67±3.79；A549为28.16±5.51。荷瘤鼠肿瘤组织中177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N的累计%ID/g分别：NCI-H292为1.91±0.97；A549为0.24±0.17。荷瘤鼠肿瘤与血液靶比值分别：NCI-H292为17.36±5.6；A549为2.40±0.12。结果提示：目标放射性药物对NCI-H292荷瘤鼠具有更好的靶向性。表明，与肿瘤新生血管细胞的特异性结合在恶性肿瘤体内靶向的过程中起着重要作用。
结论：本文设计并成功构建了一种NGR功能化修饰的透明质酸衍生物，使用荧光探针Alexa Fluro647对它进行标记实现了对该药物体外/体内的追踪，示踪结果提示该药物可被多种高表达CD44或CD13受体的肿瘤细胞摄取，实现了对CD44、CD13的协同靶向作用。荧光成像证实，DOTA/Alexa647-HA100-N可在CD13表达阳性或具有丰富新生血管形成的肿瘤组织中富集，同时该药物能在肿瘤中持续滞留至144h。此外，我们成功制备了放射性标记的177Lu-DOTA/Alexa647-HA100-N，其放射化学纯度（RCP）超过99%，该放射性化合物在体外模拟的生理条件下能保持良好的稳定性，并且能在NCI-H292荷瘤小鼠的肿瘤部位聚集。NGR功能化透明质酸衍生物的成功构建与它良好的靶向性、标记效率以及较好的体外稳定性为我们今后对肿瘤的靶向放射性治疗提供了研究基础。