论文部分内容阅读
养猪业中多种传染性疾病严重影响着猪的育种进程和生产效益,带来了巨大的经济损失。如何防治病毒感染和传播是近些年来一直被关注的热点问题。常规的疫苗接种和药物的长期使用,使得具有较强变异能力的病毒进行不断变异,最终导致病毒防治变得更加困难,因此无法从根本上解决病毒的传播。利用遗传手段修饰宿主关键基因,通过抗病育种策略培育抗病猪是预防疾病传播的一种有效方法,也是目前的研究热点,如现有的抗蓝耳病猪和抗猪瘟病毒猪都达到了良好的抗病效果。这种方法最关键的是寻找宿主体内有效的抗病基因,然而已知的有效基因很少,如何去挖掘更多的有效基因给科研工作者带来了极大的挑战。近几年,快速发展的基因组编辑技术CRISPR/Cas9能够从分子、细胞或胚胎水平对细胞或个体进行操控。CRISPR高通量筛选结合基因功能缺失能够有效地挖掘病毒抗性的关键基因。选择活性高和脱靶低的sg RNA对CRISPR高通量筛选的准确性至关重要。因此,本研究首先探讨了sg RNA的活性和特异性,对长度分别为17、18、19和20 nts的sg RNA活性和特异性进行了评估。软件预测发现长度为20 nts的sg RNA潜在的脱靶位点数量最少,因此选择长度为20 nts的sg RNA设计和构建猪的全基因组水平CRISPR/Cas9敲除文库。并利用乙脑病毒感染PK-15细胞,结合CRISPR高通量筛选技术,鉴定到多个参与介导乙脑病毒感染和复制的依赖性宿主因子,具体结果如下:1.5’末端序列长度影响sg RNA的活性和特异性发现sg RNA的5’末端序列长度对sg RNA的活性有影响。利用软件分别对靶向同一位点且长度分别为17、18、19和20 nts的sg RNA的脱靶效应进行分析发现,随着sg RNA长度变短,其预测的脱靶位点数量显著增加。2. 不同长度sg RNA的大量潜在脱靶位点中,真实脱靶位点很少通过比较6种检测sg RNA活性的方法,确定采用靶向捕获测序策略来评估不同长度sg RNA的特异性。针对靶向DMD基因同一位点不同长度sg RNA共有的潜在脱靶位点和靶点,总共设计和定制6,549个捕获探针。高通量测序结果分析显示,70%的潜在脱靶位点被成功捕获。进一步分析发现,尽管sg RNA的长度从20 nts截短为17 nts后预测的脱靶位点数量显著增加,但通过高通量测序检测到的真实脱靶位点仅为4～9个,表明不同长度sg RNA的特异性均较高。3. 脱靶位点中微卫星序列能够干扰sg RNA特异性的精确评估在分析靶向捕获测序结果时,发现对照组中大量预测的脱靶位点存在较高的编辑效率。通过分析这些脱靶位点序列特征显示,大量的微卫星存在于脱靶位点序列中,且占据不同长度sg RNA脱靶位点的25.9%（20 nts）,28.6%（19 nts）,15.4%（18 nts）和5.0%（17 nts）。长度为20 nts的sg RNA含有的所有微卫星中,（CA）8（GA）2类型微卫星达到79.2%。且随着sg RNA长度变短,又会衍生出A（CA）8GA、（CA）8GA或A（CA）7GA新类型的微卫星。当用T7核酸内切酶检测含有微卫星的脱靶位点时,对照组中能够检测到多个切割条带。说明这些微卫星序列存在于脱靶位点时,干扰了脱靶效应的精确评估。4. 设计猪的全基因组CRISPR/Cas9敲除文库根据不同长度sg RNA脱靶效应评估结果:随着sg RNA长度变短,预测的脱靶位点数量显著增加（潜在的脱靶位点数:sg RNA 17>sg RNA 18>sg RNA 19>sg RNA20）,最终选择长度为20 nts的sg RNA设计猪的全基因组水平敲除文库。用CRISPR-offinder软件设计猪的sg RNA文库,选择长度为20 nts,PAM序列为NGG,脱靶位点最多考虑3个碱基错配,脱靶分数最低的sg RNA。总共设计85,674条sg RNA,每个基因设计3条sg RNA,分别靶向17,743个蛋白编码基因、11,053个linc RNA、551个mi RNA和1,000条在猪基因组上无靶点的sg RNA作为阴性对照。5. 成功构建猪的全基因组CRISPR/Cas9敲除文库通过Gibson组装方法,制备了多于200倍sg RNA文库数量的转化子,成功获得sg RNA丰度为96.2%的猪全基因组敲除质粒库。然后通过慢病毒包装sg RNA文库,感染稳定表达Cas9的PK-15细胞系。感染了多于500倍sg RNA文库数量的细胞,成功获得sg RNA丰度为94.7%的猪全基因组水平敲除的细胞库。6. 利用猪全基因组CRISPR/Cas9敲除文库成功筛选到HSPG通路相关基因能够显著抑制JEV的复制用JEV对猪全基因组敲除细胞库进行连续4轮感染,将最后2轮存活的细胞进行高通量测序。分析发现,第3轮和第4轮筛选中富集到的sg RNA,当reads>10,000时,有44个相同的sg RNAs;当reads>1,000时,有162个相同的sg RNAs。对这些富集到的sg RNAs靶基因进行GO分析发现主要参与的生物过程包括:氮化合物代谢、内质网蛋白质折叠、硫酸肝素和糖胺聚糖生物合成等过程。主要涉及的细胞成分包括:内质网蛋白复合物、高尔基体和顺式高尔基体网络等。KEGG pathways分析显示,这些靶基因主要参与内质网蛋白折叠、糖胺聚糖（GAG）合成和硫酸肝素（HS）合成等信号通路。此外,我们发现10个显著富集的靶基因参与硫酸肝素蛋白多糖（HSPG）生物合成和代谢过程,包括:EXT1、EXT2、GLCE、HS6ST1、B3GAT3、B4GALT7、XYLT2、EXTL3、SLC35B2和GAA。因此,我们选择参与HSPG合成的关键基因SLC35B2、HS6ST1、GLCE和B3GAT3进行验证。通过构建敲除细胞系、空斑实验、绝对定量PCR和免疫荧光等实验,最终确定这4个基因敲除后能够显著抑制JEV的复制。