论文部分内容阅读
山羊DCT基因是调控山羊毛色的候选基因之一,目前市场上现有的彩色羊毛(绒)制品均是由化工染料染色而成,这不仅污染了自然环境,而且对人类身体健康会造成严重危害。若能通过对毛色基因的研究人为的控制动物毛色的改变,必将产生巨大的经济效益和社会效益。 本试验通过对山羊DCT基因5侧翼区序列及第一外显子区序列特征进行分析,发现了多个启动子调控元件,包括TATA box,GC box,M box,CAAT box,CpG岛和32 bp元件。下载人和小鼠DCT基因启动子序列,与山羊DCT基因序列进行比对,发现-648~+73 bp与人DCT基因启动子相似度较高(81%),-472~-28bp与小鼠DCT基因启动子相似度较高(78%)。根据以上生物信息学分析,结合在线启动子预测结果,利用普通分子克隆的方法构建了5个5端缺失序列的启动子预测区报告基因载体,以瞬时转染的方法转染A375细胞,双荧光素酶检测试剂检测启动子活性。结果显示,片段P3(-990~+232 bp)的活性最高,初步将核心启动子区定位在这一区域。以P3片段序列为模板,采用闪电克隆的方法构建了6个3端缺失序列的报告基因载体,瞬时转染A375细胞,检测启动子活性。结果显示,片段P8(-881~-154bp)的启动子活性最高,且极显著高于片段P3(P<0.01),因此可确定,-881~-154 bp区域为山羊DCT基因的核心启动子区。 以片段P8为模板,构建SOX10、MITF和OTX2转录因子结合位点点突变的6个报告基因载体,结果SOX10结合位点突变的载体启动子活性极显著降低(P<0.01),MITF和OTX2结合位点突变的载体启动子活性极显著增强(P<0.01)。表明转录因子SOX10对山羊DCT基因转录起到正调控作用,转录因子MITF和OTX2对山羊DCT基因调控作用尚需深入研究。 利用亚硫酸氢盐测序的方法检测了黑色和白色山羊-184 bp~+14 bp和+386bp~+665bp位置CpG岛的甲基化水平,共发现了32个甲基化位点,-184 bp~+14 bp区域两种毛色山羊平均甲基化水平差异不显著(P>0.05),+386 bp~+665 bp区域白色山羊平均甲基化水平极显著高于黑色山羊(P<0.01)。其中,+476 bp、+516bp和+564 bp位置白色山羊甲基化水平显著高于黑色山羊(0.01<P<0.05),+553bp和+568bp位置白色山羊甲基化水平极显著高于黑色山羊(P<0.01)。结果表明,+386bp~+665 bp区域DNA甲基化可能造成白色山羊DCT基因的低表达。 对唐山奶山羊、济宁青山羊、南江黄羊快长系和南江黄羊黑色系4个山羊品种各20个个体的DCT基因核心启动子区进行PCR测序,发现4个SNP位点,分别位于-640 bp、-550 bp、-543 bp和-517bp。其中,-640 bp位点TT基因型,-543 bp位点TT基因型,-517 bp位点GG基因型可能与山羊深色被毛形成有关;-640bp位点GG基因型,543 bp位点CC基因型,-517bp位点AA基因型与白色被毛形成有关;-550bp位点CC基因型可能与山羊青色被毛形成有关。 综上,-881~-154 bp区域为山羊DCT基因的核心启动子区,转录因子SOX10对其转录起到正调控作用,白色山羊+386 bp~+665bp区域DNA的高甲基化可能造成白色山羊DCT基因的低表达。DCT基因上游-640 bp、-550bp、-543bp和-517 bp位点的4个SNP在不同毛色山羊中的基因型分布差异与毛色特征的关系需进一步深入研究。