背根神经节是躯干、四肢痛觉的初级传入神经元,是机体内外环境与脊髓连接的纽带,具有传输和调节机体的各种感觉,接受和传递各种伤害性感受的功能,其在神经病理性疼痛的发生与维持中起着重要作用。阿霉素(adriamycin,ADM)是一种环蒽类抗生素类广谱抗肿瘤药物,具有自发荧光特性。抗肿瘤剂量具有明显的神经毒性和心脏毒性。近年来的研究证实,静脉内注射阿霉素可以选择性破坏外周感觉神经节,同时它可引起背根神经节细胞坏死而非凋亡。并且阿霉素具有对背根神经节高度亲和性的特点,可以引起周围神经变性,所以在动物实验中也将它作为经典的神经毒物,临床上应用它来损毁背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)细胞作疼痛治疗,即选择性感觉神经节化学切除术以治疗难治性疼痛。以往的实验中亦证实在正常大鼠或家兔椎间孔内注射高浓度的阿霉素可以引起背根神经节细胞死亡,并可导致背根神经节相应支配区域的皮肤感觉及运动功能的改变。目的:建立选择性坐骨神经损伤大鼠神经病理性疼痛模型,在SNI大鼠椎间孔内注射0.25%、0.5%、0.75%、1%的阿霉素后,应用免疫荧光双重标记的方法观察药物对同侧背根神经节细胞病理方面的影响,以及药物对大鼠的痛觉行为学方面的影响,以进一步明确各浓度阿霉素组SNI大鼠背根神经节细胞的死亡性质,为临床应用感觉神经节化学切除术以治疗神经病理性疼痛提供科学依据。方法:成年雄性SD大鼠100只,体重200g左右,参照Decosterd方法,成功建立选择性坐骨神经损伤模型后,将大鼠随机分为五组:生理盐水对照组(n=20),0.25%阿霉素组(n=20),0.5%阿霉素组(n=20),0.75%阿霉素组(n=20),1.0%阿霉素组(n=20)。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3ml/100g)麻醉,无菌条件下暴露大鼠左侧L4、L5、L6椎间孔外缘,在各组注射相应浓度阿霉素溶液5μl。分别在术后及给药后每周对各组大鼠进行一次对痛觉行为学测试,包括热辐射缩足潜伏期、丙酮试验、针刺试验。在测试完毕后,分别在给药后3、7、14、28天随机取3只大鼠左侧的L4背根神经节做成标本制成石蜡切片,进行HE染色,L5背根神经节制作成冰冻切片,进行荧光双重标记染色,分别在光学显微镜及激光共聚焦显微镜下观察阿霉素椎间孔内注射后,相对应的背根神经节组织学变化。结果一.给药前大鼠痛觉行为学的改变所有受试大鼠神经损伤同侧的后肢均表现出明显的感觉敏感性增高现象,这一现象在术后3天开始出现,并在术后14天达高峰,并在测试过程中持续存在。SNI大鼠为分担受损侧后肢承重能力而出现姿势改变,即足外翻,所有受试大鼠中有11例大鼠观察到明显的足外翻现象。大部分SNI大鼠在行走时出现跨阈步态,不论在休息还是运动时,若无意中碰触到受损侧后肢,则大鼠立即停止活动并出现较长时间的后肢屈曲。而所有受试大鼠在坐骨神经选择性损伤后未观察到明显的运动功能障碍及自噬现象,体重无明显减轻。二:给药后SNI大鼠痛觉行为学变化与正常生理盐水对照组相比较,从给药后第3天开始,不同浓度阿霉素组大鼠出现痛觉行为的逆转,表现为热痛阈(大鼠缩足潜伏期)的增加以及对冷刺激及机械性刺激后缩足持续时间的降低。0.25%浓度组、0.5%浓度组大鼠更长时间的的行为学测试结果提示,0.25%浓度组大鼠在给药后3周左右对冷热刺激及机械性刺激反应恢复至与术前相当水平,4周时未发现其行为学进一步的改变。而0.5%浓度组大鼠行为学较早恢复至术前水平,在4周时出现轻度的痛觉失敏现象,即热痛阈值较正常大鼠轻度增加、对冷刺激及机械性刺激无反应。高浓度组(1%、0.75%)从第3天起其行为学测试结果便恢复到术前测试水平,而更长时间的行为学测试结果显示,大鼠出现痛觉失敏现象,从给药后2周开始,较高浓度组大鼠出现对冷热刺激及机械性刺激反应性降低或无反应。在本实验中,1%浓度组大鼠未观察到明显的运动功能障碍及肢体瘫痪状况。三:组织病理变化1.石蜡切片组织病理变化0.25%浓度组2周时,可见背根神经节细胞肿胀、尼氏小体减少或消失;4周时,可见神经细胞核固缩胞浆均质化和细胞坏死。0.5%浓度组的大鼠在2周时已可见神经细胞普遍变性,胞浆皱缩,尼氏小体不清晰;可见神经细胞核固缩以及细胞坏死。4周可见大量神经细胞核固缩和核溶解;并见卫星现象和嗜神经节现象。0.75%及1%浓度组的大鼠2周时在相应的DRG细胞中已经能见到部分细胞核固缩、核碎裂等细胞坏死的病理改变。4周可见大量神经细胞坏死,明显胶质细胞及结缔组织明显增生取代坏死的DRG细胞。生理盐水对照组可见少量细胞变性。2.免疫荧光双重标记染色在激光共聚焦扫描显微镜下,我们观察到不同浓度阿霉素组SNI大鼠背根神经节细胞均有Bcl-2或Bax阳性神经元细胞表达。与生理盐水对照组相比,随着阿霉素浓度的递增,Bcl-2阳性神经元细胞表达率降低,并且随时间延长,同一浓度阿霉素组Bcl-2阳性神经元细胞表达率降低。Bax阳性神经元细胞表达率亦随阿霉素浓度和时间的增加而降低,而生理盐水对照组Bax阳性神经元细胞表达率则维持在较低水平。结论:在SNI大鼠神经损伤相应背根神经节椎间孔内注射不同浓度阿霉素后,可以有效逆转SNI大鼠神经病理性疼痛行为,并可不同程度地导致背根神经节细胞变性死亡。免疫荧光双重标记染色的结果提示在Bcl-2和Bax在背根神经节细胞的死亡过程中有不同程度的表达,并随时间和浓度的增加而减少,说明凋亡在背根神经节细胞的死亡过程中起一定的作用。越低浓度阿霉素引起的背根神经节细胞死亡方式越倾向于凋亡,而越高浓度阿霉素引起的背根神经节细胞死亡方式越倾向于坏死。