论文部分内容阅读
循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)是诱发癌症转移的根源,其从原始肿瘤脱落后,进入血液循环,一旦被激活,会粘附到血管内膜,从而开始了其激活-粘附-血管外侵的级联反应(activation-adhesion-extravasation),直至在远端转移组织形成转移灶。传统的“抗癌药”或靶向药倾向于在CTCs形成转移后杀死快速增殖的癌细胞,其技术缺陷在于无法逆转已形成的转移厄运。再者,由于“抗癌药”的毒副作用及其对低活性(或休眠)的微量CTCs无效,而不能用于肿瘤手术后的“亚健康人”。目前的生物纳米技术侧重于“抗癌药”与单一抗体包被的纳米材料相结合,其研发重点仅限于药物的体内传递或癌症的体外诊断,并不能有效地预防癌症的转移。另外,由于CTCs表面抗原的非单一性、其表观基因/蛋白的性质及丰度的变异性,故目前技术难以在体内达到高效识别、捕获CTCs从而预防肿瘤手术后再转移的目的。基于我们早期对安全有效的肿瘤辅助治疗的认识,和对现存生物纳米技术的概括,我们假设在生物纳米材料上连接两种能敏感识别CTCs表面抗原的抗体,可能显著提高这种纳米材料-抗体络合物对CTCs的捕获效率,从而达到安全、有效遏制体内微量CTCs的目的。本文中我们采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺催化法,首次制备多种有/无荧光标记的聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM dendrimers)-单/双靶向抗体络合物,并依据纳米材料与抗体间反应摩尔比例的不同,对络合物进行命名。我们运用红外、核磁、动态光散射、紫外、荧光成像、原子力显微镜、扫描电镜、X-射线光电子能谱等多种技术手段对络合物的分子整体及理化性质进行表征。我们采用显微荧光定性和流式定量分析法评估和测定PAMAM-单/双抗体络合物在各种条件下对目标微量癌细胞(CTCs)的捕获特异性和捕获效率,并比较PAMAM-单/双抗体络合物在捕获CTCs方面的差异。我们通过细胞存活率测定、细胞周期分布、细胞形态改变、细胞凋亡分析及线粒体膜电位变化等实验,进一步考察PAMAM-单/双抗体络合物调控癌细胞活性的能力。我们开展体外基质和内皮粘附实验,初步评估PAMAM-单/双抗体络合物干预CTCs粘附于血管内皮的可能性。研究结果表明,功能化修饰的PAMAM dendrimers表面可以依次连接上两种针对人肠(或肝)CTCs表面生物标记物(EpCAM,Slex)的靶向抗体,实现体内外对CTCs的特异性捕获和活性抑制。双抗体包被的PAMAM dendrimers络合物,无论是在体外大量干扰细胞的存在下及在临床癌症病人术后的血液样本中,还是在注射有微量荧光标记-癌细胞的裸鼠体内,都能高特异性地识别和结合到微量的目标CTCs,且展现出比其所对应的单抗体包被的络合物更高的静动态捕获效率。络合物的捕获效果还可通过其抑制所捕获CTCs的活性来进一步证明。体外粘附实验证明,PAMAM-双抗络合物相较于PAMAM-单抗络合物而言,能更有效地干预CTCs与纤连蛋白(fibronectin,Fn)包被的基质和人脐带内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)间的粘附。总之,本研究首次提供了创新性的理念依据,即采用生物相容性良好的纳米材料依次包被上双靶向抗体,可以有望实现体内对血中微量CTCs的高特异性捕获、活性抑制及干预其与血管壁的粘附,从而有效地预防癌症的转移。