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稀土元素(REEs)在环境中累积且随食物链进入生命体已成不争的事实。因此,REEs的生物安全性问题早已成为国内外众多科学家关注的焦点,但REEs的生物效应机制仍不清楚。本课题组前期研究发现,REEs与植物叶细胞接触后,最先观察到其被锚定在细胞质膜上,然后激活了植物叶细胞自身惰性的胞吞作用,此现象对研究REEs的细胞生物学效应具有重要意义。然而,REEs激活胞吞作用的机制,特别是其通过何种靶物质激活胞吞作用尚不清楚。本文以La(III)和Ce(III)为REEs代表,以模式植物拟南芥为研究对象,利用交叉学科研究方法,研究了REEs对植物叶细胞胞吞作用的激活,并探讨部分细胞下游胞吞作用相关信号转导受到的影响。本文结果将为阐明REEs细胞生物学效应的机制、REEs的安全评价提供科学依据。主要研究结果如下:(1)REEs被锚定并激活植物叶细胞胞吞作用的靶分子主要分布在细胞质膜上,且低、高浓度REEs激活胞吞作用对植物生长发育的意义不同:利用放射自显影技术研究发现,低浓度(30μmol·L-1)REEs作用于植物叶细胞后先被锚定在细胞质膜上,同时利用激光共聚焦显微镜观察到植物叶细胞胞吞作用被激活。此外,细胞质膜透性和叶片MDA含量增加不显著,说明细胞质膜未受伤害,胞吞作用被激活的主要意义可能是促进营养物质吸收;高浓度(80μmol·L-1)REEs作用于植物叶细胞后,被锚定在质膜外的REEs量增多,同时,被激活的植物叶细胞胞吞作用活性增大。此外,细胞质膜透性和叶片MDA含量显著增加,说明细胞质膜受到伤害,胞吞作用被激活的主要意义可能是内化被锚定的REEs,降低其毒害效应。更高浓度(160μmol·L-1)REEs作用于植物叶细胞后,被激活胞吞作用的活性明显降低,同时,细胞质膜透性和叶片MDA含量进一步增加,说明细胞质膜受损严重,正常生理生化功能受到破坏,不能产生胞吞作用。(2)类玻璃粘连蛋白(VN)是REEs在植物叶细胞质膜外被锚定的靶分子之一,且可能是REEs激活植物叶细胞胞吞作用的靶分子之一:利用电化学分析法研究发现低、高浓度REEs处理会使拟南芥叶细胞表面VN的量随处理浓度的增加而增加,变化规律与被激活胞吞作用活性一致。利用免疫标记法结合透射电镜观察发现,低、高浓度REEs处理使胞内VN表达量随处理浓度的增加而增加,且胞内VN向质膜方向迁移,并发现在质膜上VN和REEs分布区域有重合。利用能谱对重合区域进行分析,结果显示,VN与REEs可在同一位点出现,说明REEs被VN锚定,即VN为REEs在质膜上被锚定的靶分子。利用同源建模、分子动力学模拟和量子化学计算模拟了REEs与VN蛋白片断的相互作用。结果显示,REEs可通过与VN中O原子形成配位键而与VN结合形成路易斯酸碱配合物。同时还有氢键形成,使得配合物更加稳定。REEs与VN结合后会改变VN蛋白分子的构型和电荷分布,从而改变细胞功能和下游信号转导,启动细胞响应。VN可启动整合素调控的胞吞作用,因此,VN可能为REEs激活胞吞作用的靶分子。(3)阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)是REEs在植物叶细胞质膜外被锚定并激活胞吞作用的主要靶分子:用AGPs功能抑制剂将AGPs蛋白功能抑制后,在激光共聚焦显微镜下观察REEs激活胞吞作用情况。结果显示,被REEs激活的拟南芥叶细胞胞吞作用活性明显减弱,说明AGPs在REEs活化植物叶细胞胞吞作用的过程中起关键作用。利用电化学分析法研究发现低、高浓度REEs处理会使拟南芥叶细胞表面AGPs量随处理浓度的增加而增加,变化规律与被激活胞吞作用活性一致。利用免疫标记法结合透射电镜观察发现,低、高浓度REEs处理使胞内AGPs表达量随处理浓度的增加而增加,且胞内AGPs向质膜方向迁移,并发现在质膜上AGPs和REEs分布区域有重合。利用能谱对重合区域进行分析,结果显示,AGPs与REEs可在同一位点出现,说明REEs被AGPs锚定,即AGPs为REEs在质膜上被锚定而激活胞吞作用的靶分子。利用同源建模、分子动力学模拟和量子化学计算模拟了REEs与AGPs蛋白片断的相互作用。结果显示,REEs可通过与AGPs中O原子形成配位键而与AGPs结合形成路易斯酸碱配合物。同时还有氢键形成,使得配合物更加稳定。REEs与AGPs结合后会改变AGPs蛋白分子的构型和电荷分布,从而改变细胞功能和下游信号转导,启动胞吞作用等细胞响应。(4)REEs作用于植物叶细胞后可改变胞吞作用相关基因表达和活性,及可能影响相关蛋白功能:利用不同浓度La(III)处理野生型拟南芥及四种拟南芥ROP2基因突变体,结果显示,低浓度La(III)处理时,ROP2基因表达功能活性降低有利于根长增加,高浓度La(III)处理对于拟南芥根长变化的影响与ROP2基因表达及其功能活性无明显关系。同时发现,ROP2基因的表达量增加可以提高高浓度La(III)胁迫下拟南芥的存活率。利用实时荧光聚合酶链式反应研究La(III)处理对ROP基因表达量的影响,结果显示,低浓度La(III)处理可增加ROP2基因表达,增加拟南芥存活率,高浓度La(III)处理使ROP2基因表达降低,降低拟南芥存活率。利用免疫印迹法研究La(III)处理对ROP2活性的影响,结果显示,低、高浓度La(III)处理后,被激活的胞吞作用的活性增大与ROP2基因表达及活性变化规律一致。利用同源建模、分子动力学模拟和量子化学计算模拟了REEs与钙调蛋白(CaM)片断的相互作用。结果显示,REEs可通过与CaM中O原子形成配位键而与CaM结合形成路易斯酸碱配合物。同时还有氢键形成,使得配合物更加稳定。REEs与CaM结合后会改变CaM蛋白分子的构型和电荷分布,进而可影响下游Ca2+信号。