前列腺癌是男性好发的恶性肿瘤,在美国等西方国家的发病率和致死率均居于男性恶性肿瘤的前列,亚洲国家的发病率近年来也呈逐步上升趋势。进展期前列腺癌在初次诊断时一般是雄激素依赖性前列腺癌(androgen dependent prostate cancer,ADPC)。去势治疗是治疗ADPC的有效手段,能有效抑制肿瘤进展。但不幸的是,去势治疗失败后ADPC会转变为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)。CRPC 侵袭性增强,恶性程度高,预后不良。CRPC的发生机制是目前研究的热点和难点问题之一。其中,阐明CRPC肿瘤细胞发生雄激素非依赖性增殖(androgen-independent,AI)的机制将有助于我们识别新的治疗靶点,改善CRPC患者的临床预后。目前研究认为CRPC的发生存在雄激素受体(androgenreceptor,AR)依赖性机制和AR非依赖性机制,还有部分研究报道了 microRNA(miRNA)、错配修复蛋白缺陷、自噬及前列腺干细胞等在CRPC发生和发展中的作用。MiRNA是一种小分子非编码RNA。MiRNA为相对保守的单链,可通过与靶基因mRNA3’非翻译区(3’-untranslatedregions,3’-UTR)完全结合导致靶基因mRNA降解,但更多的是与靶基因3’-UTR发生不完全互补结合抑制靶基因的翻译和蛋白表达。MiRNA在细胞代谢、增殖、分化等过程中发挥调控基因表达的作用。MiRNA在恶性肿瘤的发生发展中也具有重要的作用。目前研究表明,miRNA在前列腺癌诊断、治疗和预后评估等方面的应用变得越来越重要。MiR-30a是miR-30家族成员之一。MiR-30家族是目前研究较为广泛的一个miRNA簇,该家族内的成员多数在恶性肿瘤表达下调,起到抑癌基因的作用。现有研究显示miR-30a在肺癌、乳腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、结直肠癌、前列腺癌和胃癌等多种恶性肿瘤中表达下调,发挥抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及诱导凋亡等作用。因此,miR-30a可能成为肿瘤治疗的潜在靶点。已有研究显示MiR-30a与前列腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移、上皮间质转化和放疗敏感性等有关,但miR-30a在CRPC中的作用和相关机制尚罕见文献报道。本研究使用生物信息学方法分析了 miR-30a在局限性前列腺癌及CRPC中的表达及意义,并通过体外细胞实验和体内动物实验探讨了 miR-30a在前列腺癌细胞AI增殖中的作用及相关机制。第一部分M i R-30a在前列腺癌中的表达和临床意义本部分研究通过生物信息学方法对多个前列腺癌公共数据库中的miRNA表达情况进行分析,筛选在局限性前列腺癌和CRPC中有意义的miRNA,并分析其与临床病理特征之间的关系。一、6个miRNAs在CRPC中的表达水平较在良性前列腺组织和局限性前列腺癌中降低:我们对10个GEO数据集进行Meta分析,发现101个miRNAs在良性前列腺组织和局限性前列腺癌组织之间存在差异表达。与良性前列腺组织相比,80个miRNA在局限性前列腺癌中表达下调,21个miRNAs在局限性前列腺癌中上调。在TCGA数据库中,对上述101个miRNAs的表达水平进行聚类分析后发现,此组miRNAs的表达谱可以较为准确的区分良性前列腺组织和局限性前列腺癌组织。我们进一步对GSE80400和Wanget al的数据进行局限性前列腺癌和CRPC间差异表达miRNA分析,并将下调的miRNAs与上述80个下调的miRNAs取交集,获得 6 个 miRNAs:miR-30a,miR-99a,miR-100,miR-205,miR-27b和miR-143。这6个miRNAs在CRPC中的表达水平较在良性前列腺组织和局限性前列腺癌中降低。二、MiR-30a在前列腺癌中低表达提示不良预后:在上述6个下调的miRNAs中,Kaplan-Meier生存曲线分析和COX单因素分析显示miR-30a低表达与前列腺癌不良预后(生化复发)高度相关。MiR-30a低表达与前列腺腺癌生化复发、高T分期、高Gleason分级分组有关。GSEA分析发现miR-30a下调的印迹基因富集于CRPC表型。第二部分MiR-30a抑制前列腺癌雄激素非依赖性增殖本部分研究中,我们通过体外细胞实验、体内动物实验以及生物信息学分析研究miR-30a对前列腺癌AI增殖的作用及可能涉及的分子信号通路。一、MiR-30a在前列腺癌细胞系中的表达:实时荧光定量PCR(real time quantitive polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析结果显示miR-30a 在前列腺癌 VCap、LNCaP、PC3、22RV1和DU145细胞系中的基础表达水平呈逐渐降低的趋势。我们选择使用雄激素依赖性LNCaP细胞系和雄激素非依赖性22RV1细胞系进行后续的研究。二、MiR-30a可抑制前列腺癌细胞体外Al增殖:在雄激素剥夺条件下,MTS、EdU和克隆形成实验结果显示过表达miR-30a可以抑制22RV1细胞的增殖和克隆形成,抑制miR-30a的表达可以提高LNCaP细胞的增殖活性和克隆形成。外源性DHT刺激降低了 miR-30a对前列腺癌增殖的抑制效应。三、MiR-30a可抑制裸鼠成瘤能力:在裸鼠去势条件下,我们将稳定转染了 miR-30a-mimics前体的LV-22RV1-miR-30a细胞和阴性对照LV-22RV1-NC细胞接种到裸鼠腋窝皮下,结果显示LV-22RVl-miR-30a组肿瘤的增殖速度和最终瘤体重量显著低于阴性对照LV-22RV1-NC组(P<0.05)。四、MiR-30a可影响细胞周期相关基因的表达水平:我们对TCGA中miR-30a高表达组和低表达组之间的差异基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)和KEGG通路分析,结果显示差异基因富集于细胞周期、细胞增殖等生物学过程和通路。流式细胞周期分析显示在22RV1细胞中过表达miR-30a会抑制G1期/S期转换,在LNCaP细胞中抑制miR-30a的表达则会促进G1期/S期转换。TCGA中细胞周期相关基因表达谱分析显示在miR-30a高表达组和低表达组之间具有差异性。RT-qPCR分析和免疫组织化学染色结果进一步验证了 miR-30a可影响细胞周期相关基因和蛋白的表达。五、MiR-30a可影响AR介导转录基因的表达:TCGA数据库中AR介导转录基因表达谱分析结果显示在miR-30a高表达和低表达组之间具有差异性。RT-qPCR分析显示miR-30a inhibitor可以降低外源性DHT对LNCaP细胞中PSA和TMPRSS2表达的激活效应,提高CDC20的表达水平;miR-30amimics则可以增强外源性DHT对22RV1细胞中PSA和TMPRSS2表达的激活效应,抑制CDC20的表达水平。这些结果提示miR-30a可以改变AR介导转录基因的表达。六、MiR-30a与AR介导转录基因或细胞周期相关基因的表达相关性:我们进一步使用TCGA数据库观察组织样本中miR-30a与AR介导转录基因或细胞周期相关基因的表达是否具有线性相关。相关性分析显示miR-30a与AR介导转录基因KLK2、KLK3、KLK4和TMPRSS2呈线性正相关(P<0.01),与细胞周期相关基因MDM2、GSK3B、MKI67、CDC20和CCNB1之间呈线性负相关(P<0.01)。第三部分MIR-30A靶基因MYBL2、FOXD1和SOX4在前列腺癌中的表达及对增殖的影响本部分研究通过生物信息学和分子生物学的方法,筛选并鉴定出两个转录因子MYBL2和FOXD1是miR-30a的靶基因,在细胞增殖过程中发挥重要作用。我们结合既往发现的miR-30a靶基因SOX4,系统探讨MYBL2、FOXD1和SOX4在前列腺癌中的表达、预后意义及其在前列腺癌AI增殖过程的作用。一、MiR-30a直接靶向MYBL2和FOXD1:生物信息分析工具预测MYBL2和FOXD1可能是miR-30a的靶基因。Western blot结果显示:与对照组相比,将miR-30a mimic转染入LNCaP和22RV1细胞后,MYBL2和FOXD1的蛋白表达显著降低,而将 miR-30a inhibitor 转染入 LNCaP 和 22RV1 细胞后,MYBL2 和 FOXD1的蛋白表达量明显升高。双荧光素酶检测发现miR-30amimics可抑制MYBL2和FOXD1的3’UTR的活性;当对MYBL2和FOXD1的3’UTR区突变处理后,上述抑制效应消失。二、在TCGA数据库中MiR-30a与SOX4、MYBL2、FOXD1的表达相关性分析:对TCGA数据库中miR-30a与SOX4、MYBL2、FOXD1的表达相关性分析发现,miR-30a与三个靶基因之间具有线性负相关性(P<0.01)。我们进一步对miR-30a印迹基因和SOX4、MYBL2和FOXD1印迹基因的表达相关性进行分析,发现它们之间同样存在线性负相关性(P<0.001)。三、SOX4、MYBL2和FOXD1在前列腺癌中的表达及预后意义:对GSE35988进行分析显示,SOX4、MYBL2和FOXD1的表达分别呈两两正相关(r=0.40～0.59,P<0.01);SOX4、MYBL2和FOXD1在CRPC中的表达高于良性前列腺组织和局限性前列腺癌(P<0.05)。主成分分析显示SOX4、MYBL2和FOXD1的印迹基因表达谱可以有效区分局限性前列腺癌与CRPC。Kaplan-Meier生存分析显示SOX4、MYBL2和FOXD1的高表达均与前列腺癌生化复发有关。四、SOX4、MYBL2和FOXD1可促进前列腺癌细胞雄激素非依赖性增殖:在雄激素剥夺条件下,MTS实验结果显示:分别在22RV1细胞转染SOX4、MYBL2或FOXD1 siRNA后可以抑制肿瘤细胞的增殖活性。另外,在LNCaP细胞中转染miR-30ainhibitor可以增强LNCaP细胞的增殖活性,但同时抑制SOX4、MYBL2和FOXD1的表达可以在一定程度上逆转上述效应。五、SOX4、MYBL2和FOXD1对细胞周期相关基因和AR依赖性转录基因的影响:我们使用RT-qPCR方法检测了 8种细胞周期相关基因的表达,结果显示转染SOX4、MYBL2 和 FOXD1 siRNA 后,CDC20、CCNB1、CDK4、E2F1、GSK3B、MKI67和MDM2的mRNA表达水平降低,FZR1的mRNA表达水平升高。在22RV1细胞中转染SOX4、MYBL2和FOXD1 siRNA可增强外源性DHT对PSA和TMPRSS2表达的激活效应,降低CDC20的表达水平。在LNCaP细胞中转染miR-30a inhibitor可抑制外源性DHT对PSA和TMPRSS2表达的激活效应,提高CDC20的表达水平;同时转染SOX4、MYBL2或FOXD1 siRNA后,上述效应减弱。综上所述,我们的研究发现miR-30a在CRPC中表达低于其在良性前列腺组织和局限性前列腺癌中的表达。miR-30a的水平与临床分期、Gleason分级分组和生化复发相关。MiR-30a低表达及其靶基因MYBL2、FOXD1和SOX4高表达是不良预后因素。MiR-30a可以通过直接靶向SOX4、MYBL2和FOXD1抑制前列腺癌细胞的AI增殖,该过程可能与细胞周期相关基因和AR介导转录基因的表达调节有关。本研究结果将为前列腺癌和CPRC的治疗策略选择以及新的治疗靶点设计提供进一步的理论依据。