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主要组织相容性复合体(MHC)分子是存在于所有有核细胞表面的一类糖蛋白分子,其主要功能是递呈相应的抗原表位,与免疫相关的MHC分子主要是MHCⅠ类分子和MHCⅡ类分子,其中MHCⅠ类分子可以结合并递呈内源性的T细胞表位,启动CTL型的免疫应答。为研究和鉴定禽源病毒的T细胞表位,我们试图在体外重建鸡的MHCⅠ类分子,并利用其进行T细胞抗原表位的鉴定,于是我们开展了相关的研究工作:1.从纯种来航鸡的全血中克隆了MHCⅠ重链(BF2)及β2m的基因序列,并进行测序。结果显示,所克隆的来航鸡BF2基因核苷酸序列为1035 bp,包含一个完整阅读框(ORF),共编码345个氨基酸,白来航鸡的BF2的单倍型为BF2*21型。来航鸡与人和其它种动物的MHCⅠ重链基因氨基酸同源性为32.6%-82.3%。克隆的纯种来航鸡β2m基因核苷酸序列为360bp,包含一个完整阅读框(ORF),G+C含量显著高于A+T含量,分别为65.56%和34.44%,共编码120个氨基酸。β2m基因序列与所参照的其他品系鸡的同源性为100%,与人和其他11种动物氨基酸同源性在24.2%-100.0%之间。BF2和β2m基因有明显的种属差异性,MHCⅠ家族在进化关系上形成了灵长类、啮齿类、两栖类和禽类等家族,禽类与哺乳动物类基本处在完全不同的大分支中,表明它们的亲缘关系很低。研究表明,SPF级纯种白来航鸡BF2和β2m基因存在明显的种属差异性,亲缘关系越近,同源性越高。其中禽类BF2基因各型同源性存在较大的差异,这些高变区多位于BF2基因α1,α2区的肽结合区。2.为获得鸡BF2成熟肽胞外区蛋白质分子和β2m成熟肽蛋白质分子,我们采用鸡BF2成熟肽胞外区基因和β2m成熟肽基因的相应引物,以来航鸡的重组质粒pGEM-T-BF2,pGEM-T-β2m为模板扩增BF2的成熟肽胞外区和β2m的成熟肽蛋白基因。然后将其分别亚克隆至pET-21a(+)重组表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,进行诱导表达,获得了以包涵体形式存在的重组蛋白,构建成功的阳性质粒分别命名为pET-21-BF2和pET-21-β2m。经SDS-PAGE检测分析,表达的白来航鸡BF2胞外区成熟肽和β2m成熟肽的分子量分别为30.88kD和11.12kD,IPTG诱导后得到了高效稳定表达。3.高效表达收获的MHCⅠ类分子BF2的胞外区成熟肽和轻链的成熟肽蛋白可以和病毒的T细胞表位发生结合。于是,我们使用BF2成熟肽胞外区和β2m成熟肽蛋白与设计合成的来源于禽流感病毒H7N7亚型NP蛋白的候选T细胞表位:P80(ELRSRYWAI)、P88(DPKKTGGPI)、P219(DPKKTGGPI)和P251(AEIEDLIFL)分别进行了体外结合试验,结合产物经非还原性SDS-PAGE电泳检测显示,体外重建的来航鸡MHCⅠ类分子的BF2胞外区成熟肽和轻链成熟肽蛋白可以与9肽P80,P219和P251结合,均能在大约43KDa的位置产生一条新生的条带。这说明体外的重建MHC I类分子可以用来筛选禽流感病毒的T细胞抗原表位,为进一步研究T细胞抗原表位以及研究表位疫苗提供有效的筛选平台。