第一部分人肝硬化及肝癌中肝脏祖细胞的激活与扩增一肝硬化中肝脏祖细胞的激活与扩增目的证实肝硬化组织中存在人肝脏祖细胞(HPCs),探讨HPCs分布及激活的强度与肝脏炎症程度的关系,提供HPCs向肝细胞分化的依据。方法对30例肝硬化及3例正常组织标本进行常规组织学观察,对门脉炎症程度进行评分,并用胆管上皮标志CK7和肝星状细胞激活标志SMA进行免疫组化染色,对符合HPCs、中间型肝细胞以及小管样反应的细胞进行计数和半定量评分。结果在正常肝组织中无门脉周围HPCs和小管样反应增殖。在肝硬化组织中,增殖的HPCs起源于肝门脉区域,随着门脉炎症程度加重,HPCs及小管样反应从肝硬化结节周围向肝实质扩散并出现中间型肝细胞增殖,其周围有显著的肝星状细胞激活。HPCs及小管样反应增殖程度随着门脉炎症程度的加重而增加。HPCs数目与中间型肝细胞数目之间存在正直线相关。ALT和AST与HPCs及中间型肝细胞数目存在正直线相关。结论在人肝硬化中存在祖细胞的激活,炎症反应是HPCs激活的触发因素,HPCs向肝实质内迁移并向肝细胞方向分化是肝再生的重要途径。二肝硬化中肝脏祖细胞的表型特征研究目的研究不同肝脏祖细胞标志物在人肝硬化组织中的定位和分布,明确肝脏祖细胞群的免疫表型特征。方法用OV-6,CK7,CK19,Hepatocyte, c-kit以及AFP对30例肝硬化及3例正常肝组织进行免疫组化染色和激光共聚焦免疫荧光双标,观察这些标志物在不同细胞群中的分布。结果正常肝脏中,胆管和胆小管上皮CK7及CK19阳性,OV-6及c-kit阴性。在肝硬化中,门脉周围区域的肝脏祖细胞(HPCs)及小管样反应细胞主要为OV-6(+)/ CK19(+)/CK7(+)/ Hepatocyte(+),少数为OV-6(-)。随着门脉及实质内炎症的加重,HPCs及小管样反应从肝硬化结节周围向肝实质扩散并出现中间型肝细胞增殖。HPCs及小管样反应细胞主要为OV-6(-)/CK19(+)/CK7(+),Hepatocyte(-)或(+);中间型肝细胞为OV-6(-)/CK19(-)/CK7(+)/ Hepatocyte(+),少数Hepatocyte(-)。门脉周围区域和纤维间隔内存在少量的c-kit(+)细胞,个别阳性细胞整合到成熟胆管,其余c-kit(+)细胞不共表达OV-6、CK7及CK19。结论人肝硬化存在肝脏祖细胞的激活;肝脏祖细胞群的免疫表型差异表明祖细胞处于不同的分化增殖阶段;不同肝脏祖细胞标志物的联合运用是鉴别和研究肝脏祖细胞的有力工具。三c-kit、CK7在人肝细胞肝癌中的表达及意义目的研究肝脏祖细胞标志物c-kit、CK7在肝细胞肝癌(HCC)组织中的表达及其与临床病理的关系。方法对40例肝细胞肝癌标本及3例正常组织标本进行常规组织学观察以及c-kit、CK7、CD45免疫组化染色,对肿瘤细胞的分化程度进行分型,分析c-kit、CK7表达与肝细胞肝癌的临床病理特征的联系。结果正常肝脏中c-kit染色阴性。19/40例HCC组织中存在c-kit(+)肿瘤细胞,在肿瘤细胞之间或肿瘤结节周围分散分布。30例(75%)存在CK7阳性癌细胞,阳性程度强弱不一,主要存在两种不同免疫反应形态特征。HBsAg及Anti-HBc在c-kit(+)及CK7(+)HCC表达更常见(p<0.05),c-kit、CK7表达与肿瘤的分化程度紧密相关(p<0.05)。结论骨髓来源的肝脏祖细胞参与了HCC的形成和发展,c-kit、CK7对于判断HCC预后有一定意义。第二部分肝脏微环境参与卵圆细胞介导的肝再生目的阐明在卵圆细胞介导的肝再生中肝脏非实质细胞、胞外基质成分与卵圆细胞的相互作用,分析肝脏微环境对卵圆细胞的调控作用。方法采用免疫组化及免疫荧光双标的方法动态观察在2-AAF/PH大鼠卵圆细胞增殖模型中,随着卵圆细胞的增殖和分化,Kupffer细胞、肝星状细胞、肝脏胞外基质成分(层粘连蛋白和纤维连接蛋白)的定位及与卵圆细胞的相互关系。结果PH后第2天,小卵圆细胞开始向门静脉周围区域增殖。Desmin(+)的HSCs及laminin主要出现在门静脉周围的肝窦状隙内,而Kupffer细胞和fibronectin在整个肝小叶内表达显著增加。从术后第4到第9天,卵圆细胞进一步向肝实质内增殖,与HSCs、laminin及fibronectin关系密切,Kupffer细胞与卵圆细胞混合在一起增殖,第6天以后开始减少。从术后第12到第15天,随着卵圆细胞分化为小肝细胞节结,大多数HSCs、laminin及fibronectin位于节结周边,少数出现在节结内,Kupffer细胞主要出现在中央静脉周围区域。第18天以后,正常的肝小叶结构开始恢复。结论在肝损伤后的重建修复过程中,卵圆细胞与肝脏非实质细胞、胞外基质成分存在紧密的联系,局部肝脏微环境可能通过细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的相互作用在卵圆细胞介导的肝再生中发挥重要的调控作用。第三部分大鼠肝卵圆细胞的分离、鉴定、培养及端粒酶的表达目的建立大鼠卵圆细胞增殖模型,探讨其分离、鉴定、培养的方法;检测卵圆细胞端粒酶活性及相关基因表达,探讨与其增殖分化之间的关系。方法采用2-AAF/PH模型诱导大鼠卵圆细胞增殖,2-AAF剂量为15mg/kg,于术后9-12天采用改良的胶原酶灌注消化密度梯度离心法分离卵圆细胞,用电镜、RT-PCR、细胞免疫荧光鉴定卵圆细胞,采用免疫组化、RT-PCR及端粒酶活性检测试剂盒检测分离的卵圆细胞及卵圆细胞系LE6端粒酶的表达,并分析其意义。结果采用2-AAF/PH模型成功诱导大鼠卵圆细胞增殖。分离的卵圆细胞核大,卵圆形,胞浆少,呈铺路石样生长,细胞直径约7～12μm,电镜观察发现有少量绒毛样突起,核浆比例大,胞浆内细胞器少且发育不成熟。细胞免疫荧光、RT-PCR结果显示表达0V-6、AFP、CK19、Albumin、C-KIT、CK18、Thy-1。免疫组织化学显示端粒酶催化亚单位TERT表达在门静脉周围增殖的卵圆细胞细胞核内,随着卵圆细胞逐渐向肝细胞方向分化,TERT阳性细胞数目显著较少。分离的卵圆细胞及卵圆细胞系均表达端粒酶亚单位TERT及TR,与LE6相比,刚分离的卵圆细胞表达水平更低;随着LE6传代次数的增加,端粒酶活性逐渐降低。结论采用剂量为15mg/kg的2-AAF/PH模型可诱导卵圆细胞大量增殖;改良的胶原酶灌注消化、密度梯度离心的分离方法可获取纯度较高的卵圆细胞;端粒酶活性可能是卵圆细胞维持其增殖能力和多分化潜能的一个必要条件。