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目的:疟疾是疟原虫引起，由媒介按蚊传播的全球最威胁生命的传染病之一。世界卫生组织发布的《2016年世界疟疾报告》指出，2015年全球有2.12亿例疟疾新发病例和42.9万死亡病例。按蚊对杀虫剂的抵抗、疟原虫对青蒿素为基础的联合疗法耐药性的产生及缺乏有效的疟疾疫苗对疟疾的治疗和防控造成很大困难。其主要原因在于疟原虫与宿主之间的相互作用机制尚不十分清楚。因此，阐明疟原虫与宿主之间的相互作用迫在眉睫。 疟原虫已经进化出较为完善的机制来逃避宿主免疫的攻击。其中，疟原虫可以表达与宿主同源的蛋白，使宿主对其耐受，而宿主的免疫系统对这些包含同源区域的抗原表位产生不同的免疫效应。例如，疟原虫可以分泌人类巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）同系物并参与宿主的免疫应答，这提供了疟原虫一种新的免疫逃避机制。有研究者通过序列分析在疟原虫基因组中发现与人类T细胞免疫调节蛋白（T-cell immunomodulatory protein，TIP）基因同源的序列，该蛋白被注明为假设蛋白Q8I3H7。但是，目前还未见关于疟原虫TIP(pTIP)作用及作用机制研究的相关报道，对pTIP的研究可能会给深入了解疟原虫与宿主免疫系统之间的相互作用提供帮助。 本研究利用生物信息学软件分析获取伯氏疟原虫(Plasmodium bergheiANKA，Pb)tip基因克隆片段，构建原核pET32a-TIP-EX和真核VR1020-TIP-EX表达载体，应用获取的重组蛋白rpbTIP(recombinant pbTIP)与真核表达载体分别免疫雌性C57BL/6小鼠获得多克隆免疫血清，来研究pbTIP在不同发育阶段的表达和定位情况，并探索pbTIP在疟疾发生发展过程中对宿主免疫效应的调节作用，为揭示疟原虫与宿主之间的相互作用提供理论和实验依据。 研究方法: 1、目的基因的获取及表达载体的构建 利用生物信息学预测软件对pbTIP蛋白的结构域、跨膜区、同源性和抗原决定簇进行生物信息学分析，选取主要的功能域、分泌到细胞外、同源性高和抗原决定簇较高的区域，并排除信号肽、跨膜域和低复杂区域，以便更高效合成蛋白。获取目的基因，构建原核pET32a-TIP-EX和真核表达载体VR1020-TIP-EX。 2、重组蛋白的表达与纯化 将正确测序的原核表达载体pET32a-TIP-EX转化入E.coli RGB中，经IPTG诱导表达rpbTIP，经SDS-PAGE正确验证后，收集、纯化rpbTIP。 3、真核表达载体的瞬时表达 将测序正确的真核表达载体VR1020-TIP-EX转染COS7细胞，孵育48小时后用IFA方法检测其在COS7细胞中的表达。 4、免疫活性检测 用rpbTIP和真核表达载体VR1020-TIP-EX分别免疫6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，每两周免疫一次，共免疫三次，静置离心取血清。应用ELISA方法以rpbTIP为抗原，1∶200稀释免疫血清作为一抗，1∶5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗，检测抗体效价。 5、pbTIP表达情况的检测 分别分离培养和纯化裂殖体、配子体及动合子期疟原虫;分别提取纯化后的各期疟原虫总RNA，并反转录成cDNA，特异性引物扩增验证pbTIP在各期的表达情况;收集各期虫抗原的蛋白，利用Western blot和IFA技术进一步验证pbTIP在各期的表达情况。 6、pbTIP对促炎症因子作用检测 被动转移抗rpbTIP多克隆血清的小鼠，疟原虫攻击后第5天收集血清，应用ELISA分析血清中促炎症因子IFN-γ和TNF-α变化。 7、统计学分析 数据以均数±标准差((X)±SD)表示，采用SPSS17.0统计软件对实验数据进行处理，标准采用独立样本t检验，P＜0.05表示有统计学差异，P＜0.01表示有明显差异。 结果: 1、目的基因的获取及表达载体的构建 选取了pbTIP第204-335位氨基酸，即第610-1005位碱基序列。PCR扩增pbtip目的基因，分别连接到原核、真核表达载体上，经筛选、酶切、测序正确，表明这两种表达载体构建成功。 2、重组蛋白的表达及纯化鉴定 SDS-PAGE检测蛋白表达情况，pET32a-TIP-EX表达蛋白约35kDa左右，与预期结果相符。纯化后可见清晰的目的蛋白条带，大小约为35kDa，与预期结果一致。 3、真核表达载体瞬时表达 VR1020-TIP-EX表达载体转染真核细胞COS7可在细胞浆中观察到绿色荧光，对照组则不见荧光。说明VR1020-TIP-EX表达载体能在真核细胞中表达。 4、免疫活性检测 ELISA结果显示，与对照组相比，rpbTIP组血清IgG水平在第二次免疫后14天升高(P＜0.05);第三次免疫后7天明显高于对照组(P＜0.01)。血清特异性IgG最高滴度为1∶12800。 5、RT-PCR验证pbtip的表达 琼脂糖凝胶电泳显示在全虫、裂殖体、配子体、动合子时期均有大约120bp的条带，与预期结果一致。 6、Western blot验证pbTIP表达 Western blot显示，重组蛋白和真核组免疫血清均与疟原虫裂殖体、配子体和动合子期抗原反应，天然蛋白大小为80kDa左右，与预期结果一致，说明pbTIP存在于上述各阶段。 7、间接免疫荧光定位 IFA结果显示pbTIP蛋白分布在疟原虫裂殖体，配子体，动合子期。 8、pbTIP免疫调节作用检测 ELISA显示，多克隆血清被动转移给小鼠后，疟原虫攻击该小鼠与对照组相比，促炎性因子IFN-γ和TNF-α表达水平明显降低，P＜0.05。 结论:1、验证了pbTIP同时表达在裂殖体，配子体及动合子时期。2、抗rpbTIP多克隆抗体封闭虫体pbTIP抑制宿主促炎症因子IFN-γ和TNF-α的调节。