现代生活中,随着社会的发展和生活节奏的加快,精神紧张或心理负担过重已经成为常见的应激源,而由此引起的心理应激及其对人体健康的影响正越来越受到人们的重视。许多研究证实,心理应激可增加多种疾病的发病风险,包括糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病以及衰老。铁是几乎所有生命体必不可少的微量元素。在细胞呼吸链电子传递、能量代谢、血红素代谢、氧的运输、细胞信息传递、DNA合成、免疫功能等方面发挥重要作用。除了重要的生理功能外,铁也是一种可以诱导氧化应激的促氧化剂,铁过量会对机体产生不利影响。有实验证实,铁过负荷可以通过Fenton反应对机体造成氧化应激损伤。课题组前期研究发现,心理应激可引起机体铁代谢紊乱,造成小肠铁吸收减少,血清铁明显下降、红细胞生成受到抑制,同时肝细胞铁含量明显增加,部分脑区铁蓄积增加,氧化应激增强。因此,了解膳食铁补充对心理应激大鼠血清铁降低是否有改善作用,以及对心理应激所造成的铁代谢紊乱和氧化应激损伤的影响,对于阐明心理应激人群是否应补铁具有重要的意义。研究目的本实验通过观察喂饲不同铁含量的饲料对心理应激模型大鼠铁代谢和氧化应激反应的影响,为心理应激情况下是否应补充铁提供实验依据。研究方法一、膳食铁补充对心理应激大鼠铁吸收的影响(一)实验动物分组雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重(120±10)g。按体重随机分为空白对照组(CG)、心理应激组(PSG),每组各16只。CG及PSG又按体重随机分为两个亚组：正常铁组(NFe,35 mgFe/kg diet, n=8),高铁组(HFe,245 mg Fe/kg diet, n=8)。动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%-60%；单笼饲养,自由饮食及去离子水,饲料配方为AIN-93G,仅铁含量的配制按实验需要添加。自然昼夜节律变化光照。(二)大鼠心理应激模型制作采用Communication Box System制作大鼠心理应激模型。Communication Box System由透明丙烯酸板组成,一半小室(A室)底部铺板绝缘,另一半小室(B室)通电。在B室的实验大鼠接受30min／d,足底电击(电压90V,电流0.80mA)；电击组大鼠跳跃,尖叫,在A室的实验大鼠通过视觉听觉产生恐惧的心理反应,即为心理应激大鼠模型。心理应激组连续心理应激7天。(三)大鼠饲料摄入量和体增重测定使用电子天平称量大鼠饲料日摄入量和应激暴露前、应激暴露每天的体重,并将后一天体重和前一天体重的差值作为大鼠的体增重。(四)大鼠粪便收集分别收集CG和PSG大鼠在实验第一、三、七天中所产生的粪便。为使粪便收集齐全,将大鼠从代谢笼中移至心理应激模型的过程中,大鼠单个塑料笼转运。为使粪便收集精确,通过卡红标记粪便(收集两次红色之间的粪便,不包括第二次红色粪便)。(五)大鼠铁表观吸收率及吸收量的计算大鼠铁表观吸收率采用经典的代谢平衡法计算(由于尿中铁含量甚微,故忽略不计)。铁表观吸收率=(摄入铁含量-粪便铁含量)×100%／摄入铁含量；铁吸收量=摄入铁含量-粪便铁含量二、膳食铁补充对心理应激大鼠组织铁含量的影响(一)实验动物分组雄性SD大鼠(购自上海西普尔-必凯公司),体重(120±10)g。按体重随机分为空白对照组(CG)、心理应激组(PSG),每组各24只。CG及PSG又按体重随机分为三个亚组：低铁组(LFe,80 mg Fe/kg diet, n=8),中铁组(MFe,160 mg Fe/kg diet, n= 8)高铁组(HFe,320 mg Fe/kg diet, n=8)动物饲养实验室环境温度24℃±1℃,湿度50%～60%；使用代谢笼具单笼饲养,自由饮食及去离子水,喂饲天然饲料,饲料中仅铁含量按实验要求配置。自然昼夜节律变化光照。(二)心理应激模型制作方法同前。(三)大鼠血清、肝脏及各脑区铁含量的测定湿法消化法各组织,火焰原子吸收分光光度法测定各组大鼠血清、肝脏及部分脑区的铁含量。三、膳食铁补充对心理应激大鼠氧化应激损伤的影响(一)实验动物分组同上。(二)心理应激模型制作同上。(三)大鼠脑区及肝脏内MDA含量的测定采用丙二醛(MDA)测定试剂盒所定的方法测定心理应激组和对照组大鼠皮层、海马、纹状体、脑干、小脑以及肝脏内MDA的含量。(四)大鼠脑区及肝脏内SOD活力的测定：超氧化物歧化酶(SOD)分析试剂盒-WST(水溶性四唑盐)试剂盒测定心理应激组与对照组大鼠皮层、海马、纹状体、脑干、小脑以及肝脏内SOD的活力。(五)大鼠脑区及肝脏内GSH含量的测定：总谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒测定心理应激组与对照组大鼠皮层、海马、纹状体、脑干、小脑以及肝脏内总GSH含量。(六)大鼠脑区及肝脏内GSH-Px活力的测定：谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定试剂盒测定心理应激组与对照组大鼠皮层、海马、纹状体、脑干、小脑以及肝脏内GSH-Px活力。四、数据统计与处理实验数据采用SPSS1 3.0统计软件包采用两样本t检验及单因素方差分析进行数据分析,实验数据以平均数±标准差(X±S)表示,显著性水平为P<0.05,非常显著性水平为P<0.01。结果一、膳食铁补充对心理应激大鼠铁吸收的影响(一)膳食铁补充对心理应激大鼠鼠粮摄入量及体增重的影响喂饲不同膳食铁含量的心理应激组及空白对照组大鼠第1天,第3天和第7天鼠粮摄入量及体增重均无明显差异(P>0.05)。(二)膳食铁补充对心理应激大鼠铁表观吸收率的影响没有经过心理应激暴露的高铁摄入组大鼠铁表观吸收率比没有经过心理应激暴露正常铁摄入组低(P<0.05)；不同膳食铁含量的两组大鼠在心理应激暴露后其铁表观吸收率均显著降低,且随着心理应激天数的增加下降幅度逐渐加大(P<0.05),其中高铁摄入组大鼠铁表观吸收率降低幅度最大。(三)膳食铁补充对心理应激大鼠铁吸收量的影响没有经过心理应激暴露的高铁摄入组大鼠铁吸收量比没有经过心理应激暴露正常铁摄入组显著增加(P<0.01)；不同膳食铁含量的两组大鼠心理应激暴露后铁吸收量均显著降低(P<0.05),且随着心理应激天数的增加下降幅度逐渐加大；但心理应激高铁组大鼠铁吸收量比心理应激正常铁组明显增多(P<0.01)。二、膳食铁补充对心理应激大鼠肝脏、血清、皮层、海马、纹状体、小脑及脑干铁含量的影响(一)膳食铁补充对心理应激大鼠肝脏铁含量的影响未经过心理应激暴露的各组大鼠肝脏铁含量随着膳食铁含量的增加而增加,其中,高铁组与低铁组相比增加了116.7%(P<0.01)；在不同膳食铁含量的三组大鼠中,心理应激暴露后各组大鼠肝脏铁含量均较相应未经心理应激暴露的对照组有显著性升高(P<0.01)；而心理应激暴露的各组大鼠肝脏铁含量也随着膳食铁含量的增加而增加,高铁应激组与低铁应激组相比增加了129.2%(P<0.01)。(二)膳食铁补充对心理应激大鼠血清铁含量的影响未经过心理应激暴露的各组大鼠血清铁含量随着膳食铁含量的增加而增加,其中,高铁组与低铁组相比增加了49.6%(P<0.01)；在不同膳食铁含量的三组大鼠中,心理应激暴露后各组大鼠血清铁含量较相应未经心理应激暴露的对照组有显著性的降低(P<0.05)。而心理应激暴露的各组大鼠血清铁含量也随着膳食铁含量的增加而增加,高铁应激组与低铁应激组相比增加了52.0%(P<0.01)。(三)膳食铁补充对心理应激大鼠不同脑区铁含量的影响未经过心理应激暴露的各组大鼠海马、皮层、纹状体及小脑铁含量随着膳食铁含量的增加而增加(0.001<P<0.01)；在不同膳食铁含量的三组大鼠中,心理应激暴露后各组大鼠海马、皮层、纹状体及小脑铁含量均较相应未经心理应激暴露的对照组有显著性升高(P<0.05)；而心理应激组大鼠海马、皮层、纹状体及小脑铁含量也随着膳食铁含量的增加而增加,增加幅度大于未经心理应激暴露的大鼠(P<0.05)。三、膳食铁补充对心理应激大鼠氧化应激损伤及抗氧化酶活力的影响(一)膳食铁补充对各组大鼠不同脑区及肝脏内MDA含量的影响未经过心理应激暴露的各组大鼠皮层、海马、纹状体、小脑及肝脏MDA含量随着膳食铁含量的增加而增加,其中高铁组与低铁组相比,皮层增加23.4%,海马增加19.8%,纹状体增加81.8%,小脑增加114.7%,肝脏增加60.8%(P<0.05)；在高铁膳食组中,心理应激暴露后大鼠海马、皮层、纹状体、小脑及肝脏MDA含量较未经心理应激暴露的高铁对照组有显著性升高(P<0.01)；而心理应激组大鼠皮层、海马、纹状体、小脑及肝脏MDA含量也随着膳食铁含量的增加而增加,其中高铁应激组与低铁应激组相比,皮层增加47.1%,海马增加33.3%,纹状体增加115.7%,小脑增加205.3%,肝脏增加71.6%(P<0.01)。(二)膳食铁补充对各组大鼠不同脑区及肝脏GSH含量的影响未经过心理应激暴露的各组大鼠脑干、海马、纹状体及小脑GSH含量随着膳食铁含量的增加而依次降低；在低铁组大鼠所有脑区中,心理应激暴露后GSH含量显著降低(P<0.05)；心理应激组大鼠各脑区GSH含量未随着膳食铁含量的增加发生显著变化。未经过心理应激暴露的各组大鼠肝脏GSH含量随着膳食铁含量的增加而降低(P<0.01)；在不同膳食铁含量的三组大鼠中,心理应激暴露后各组大鼠肝脏GSH的含量显著降低(P<0.01)；心理应激组大鼠肝脏GSH含量随着膳食铁含量的增加进一步降低(P<0.01)。(三)膳食铁补充对各组大鼠不同脑区及肝脏内SOD活力的影响未经过心理应激暴露的各组大鼠肝脏及海马、纹状体及小脑SOD活力随着膳食铁含量的增加而降低(P<0.05)；在中铁组海马、纹状体、小脑部位以及高铁组海马、皮层、纹状体、小脑部位,心理应激暴露后SOD的活力显著降低(P<0.01)；心理应激组大鼠肝脏及各脑区SOD活力均随着膳食铁含量的增加而降低,较对照组显著(P<0.01)。(四)膳食铁补充对各组大鼠脑区及肝脏内GSH-Px活力的影响未经过心理应激暴露的各组大鼠部分脑区中GSH-Px活力随着膳食铁含量的增加而降低,如皮层及小脑,分别降低了35.2%和13.2%(P<0.01)；在不同膳食铁含量的三组大鼠中,心理应激暴露后各组大鼠皮层及小脑GSH-Px的活力显著降低(P<0.05)；心理应激组大鼠部分脑区GSH-Px活力随着膳食铁含量的增加而降低,如皮层及小脑,分别降低39.7%和41.8%(P<0.01)。未经过心理应激暴露的各组大鼠及心理应激组大鼠肝脏GSH-Px活力随着膳食铁含量的增加均没有显著变化；在喂饲不同膳食铁含量的三组大鼠中,心理应激暴露后各组大鼠GSH-Px活力显著降低(P<0.01)。结论运用Communication Box复制SD大鼠心理应激模型,观察喂饲不同铁含量的饲料对心理应激模型大鼠铁代谢和氧化应激反应的影响。结果发现：1、正常大鼠铁表观吸收率随着膳食铁含量的增加而降低；不同膳食铁含量的两组大鼠在心理应激暴露后其铁表观吸收率均进一步降低,其中高铁摄入组降低幅度最大。但是,不论有无心理应激,膳食补充铁均可使大鼠铁吸收量明显增加；2、膳食补铁可以缓解心理应激所导致的血清铁降低幅度。但同时使应激大鼠肝脏及部分脑区铁蓄积进一步增加。3、心理应激可以使大鼠部分脑区及肝脏抗氧化酶活性降低,MDA含量增加。而膳食补铁可导致心理应激大鼠肝脏及部分脑区铁蓄积进一步增加,同时使肝脏及以上脑区抗氧化酶活力进一步降低,脂质过氧化产物含量进一步增加。综上所述,表明膳食补充铁可以缓解应激引起的低铁血症,但同时可加重肝脏和海马、纹状体等脑区的铁蓄积和氧化应激,因此,为了维护经常处于心理应激人群的健康,有关该人群的适宜铁摄入量需要进行深入研究。