目的:骨关节炎是一种进展性的以关节软骨退变为主要特征的关节疾患,它的预防,诊断及治疗给世界社会经济医疗保健带来重大负担。即使这样,仍然没有理想的专门针对骨关节炎的治疗方法,患者最终只能选择人工关节置换,这种4级骨科大手术带来的创伤及并发症使一部分高龄患者只能望而却步。目前的治疗药物仅能暂时缓解膝关节疼痛,并不能阻止或减缓骨关节的退变。因此目前迫切需要我们更深入的了解骨关节炎的发病机制,找到一种有效的预防或治疗骨关节炎的方法。本研究旨在研究(1)异甘草素对骨关节炎软骨细胞中NF-κB通路及降解因子的影响。(2)异甘草素对早期骨关节炎软骨下骨中RANKL-RANK-TRAF6信号通路及TGF-β1的影响。(3)基于RANKL-RANK-TRAF6信号通路探究异甘草素对早期骨关节炎软骨下骨异常血管形成的影响。方法:(1)异甘草素对骨关节炎软骨细胞中NF-κB通路及降解因子的影响。1.诱导ATDC细胞系向软骨细胞分化:小鼠前软骨细胞株,来源于鼠畸胎瘤的ATDC5细胞系由南京科百生物技术有限公司提供。分别在诱导培养基诱导第0天,7天,14天,21天进行1%阿尔辛蓝染色及通过RT-q PCR测定软骨细胞内Ⅱ型胶原及Ⅹ型胶原的表达量,以确定最佳诱导时间。2.CCK-8及PE-Annexin V/7-ADD双荧光标记流式细胞分析评估异甘草素对IL-1β干预后的ATDC软骨样细胞的活性影响:此时分为两组,一组测定异甘草素单独对ATDC软骨样细胞的活性影响,根据加入异甘草素的浓度分为6组(0μmol/l,2.5μmol/l,5μmol/l,10μmol/l,20μmol/l,40,μmol/l),每组每个点设定3个复孔,培养48h后收集细胞进行CCK-8检测及双荧光标记流式细胞分析。另一组测定异甘草素对IL-1β干预后的ATDC软骨样细胞的活性影响,设定为空白对照组(无异甘草素及IL-1β),IL-1β干预组(10ng/ml),及不同浓度的异甘草素治疗组(10ng/ml IL-1β+2.5μmol/l异甘草素;10ng/ml IL-1β+5μmol/l异甘草素;10ng/ml IL-1β+10μmol/l异甘草素;10ng/ml IL-1β+20μmol/l异甘草素;10ng/ml IL-1β+40μmol/l异甘草素)。先在软骨细胞中加入不同浓度的异甘草素培养1小时后再加入10ng/ml IL-1β,继续培养48小时后收集细胞进行CCK-8检测及PE-Annexin V/7-ADD双荧光标记流式细胞分析。3.异甘草素抑制IL-1β干预ATDC软骨样细胞后的降解反应:使用TRIzol提取各组细胞总RNA用于Real-time PCR分析,测定软骨细胞降解标记物Ⅱ型胶原(COLⅡ),环氧合酶-2(COX-2),基质金属蛋白酶13(MMP-13)。4.异甘草素对NF-κB通路的影响:使用蛋白免疫印迹法(Western Blot)测定软骨细胞降解过程相关标记物,软骨细胞凋亡相关标记物Bcl-2,Bax,caspase-3,cleaved-caspase-3,caspase-9,cleaved-caspase-9,NF-κB通路相关标记物NF-κB-p65,磷酸化的p65(phospho-p65)。(2)异甘草素对骨关节炎早期软骨下骨中RANKL-RANK-TRAF6信号通路及TGF-β1的影响。1.建立C57BL/6J小鼠骨关节炎模型:C57BL/6J小鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司,预实验分5个组来选定最佳治疗剂量,假手术组,模型组,腹腔注射异甘草素治疗组-低剂量(10mg/kg),异甘草素治疗组-中剂量(20mg/kg),异甘草素治疗组-高剂量(40mg/kg)。后根据预实验结果选定最佳实验剂量40mg/kg。采用腹腔注射氯胺酮+安定+阿托品各一支混合稀释至10ml(0.1ml/10g)麻醉小鼠,麻醉起效后,右膝关节部备皮消毒,铺单,在显微镜直视下切断前交叉韧带,术后连续3天给予皮下注射氨苄青霉素,1次/天。假手术组只切开关节囊,不切断前叉韧带,余处理与手术组相同。2.评估造模后各组间小鼠膝关节软骨的各项指标:各组小鼠于术后30天及60天处死,标本脱钙包埋后先用HE染色及番红-固绿染色,观察软骨的退变情况及蛋白聚糖的丢失情况。同时,最后我们用国际骨关节炎协会(Osteoarthritis Research Society International)改良版评分来对关节软骨的破坏程度给予定量分析。我们采用免疫组织荧光染色及免疫组织化学染色测定软骨中的标记物lubricin,Ⅹ型胶原(Col X),基质金属蛋白酶13(MMP-l3)。3.评估造模后各组间小鼠膝关节软骨下骨的各项指标,探究异甘草素抑制TRAP+破骨细胞的机制:我们将样本置于三维Micro-CT(Sky Scan1176)扫描,扫描后的数据运用专用软件进行三维重建及分析(NRecon v1.6,CTAn v1.9和CTVol v2.0),分析各组之间小鼠软骨下骨骨重建的相关指标:包括a.骨体积在同体积中所占有的量(BV/TV);b.骨小梁模式因子(Tb.pf);c.软骨下骨骨小梁的厚度(SBP Th.)。我们通过免疫组织化学染色评估了TRAP+的破骨细胞,Osterix,TGF-β1通路p Smad2/3,通过免疫组织荧光染色测定各组的RANKL,TRAF6,Nestin+的骨髓间充质干细胞(MSCs)。此外,通过Elisa试剂盒检测小鼠体循环内破骨细胞相关因子的表达。(3)基于RANKL-RANK-TRAF6信号通路探究异甘草素对软骨下骨异常血管形成的影响。1.使用三维Micro-CT扫面造影剂灌注后的样本来分析异甘草素对小鼠软骨下骨异常血管形成的影响,包括血管的体积及数量。2.异甘草素对造模后各组间小鼠膝关节软骨下骨血管形成相关因子的影响:运用免疫荧光染色评估软骨下骨CD31及Endomucin来确定H型血管(CD31+Endomucin+)的变化。其次检测了基质金属蛋白酶2(MMP-2)在各组中的变化。结果:(1)异甘草素对骨关节炎软骨细胞中NF-κB通路及降解因子的影响:1.诱导期第14天,通过1%阿尔新蓝染色可见,ATDC5细胞系分泌大量的蛋白多聚糖,染色成明显蓝色,诱导期第21天仍然可以看到明显的蓝色,但和14天没有明显差异。在诱导培养基成软骨细胞诱导14天内,Ⅱ型胶原的表达量逐渐上升并在14天达到峰值,第21天时有明显下降。同时,Ⅹ型胶原的表达量逐渐增加,到21天达到峰值。因此,我们选取诱导14天的ATDC5软骨样细胞作为后续实验的样本。2.异甘草素浓度在10μmol/l以内时,对ATDC5软骨样细胞活性未见明显影响(p>0.05),但在20μmol/l及40μmol/l时明显降低ATDC5软骨样细胞活性,通过流式细胞分析也同样可看到,当异甘草素浓度升高至20μmol/l时,大量细胞开始凋亡(p<0.05)。10ng/ml IL-1β作用在ATDC5软骨样细胞后细胞活性明显降低(p<0.05),大量细胞凋亡,而随着加入异甘草素的浓度逐渐增多至10μmol/l,细胞活性逐渐升高,凋亡的细胞逐渐减少。但异甘草素浓度达到20μmol/l时,细胞活性再次明显降低,大量细胞凋亡(p<0.05)。3.Ⅱ型胶原的表达量在单纯加入10ng/ml IL-1β后有明显的下降(p<0.05),但随着加入的异甘草素的浓度逐渐增加,成浓度依赖性的增加(p<0.05)。相反,环氧合酶2(COX-2)和基质金属蛋白酶13(MMP-13)的表达量在10ng/ml IL-1β刺激后明显升高(p<0.05),但随着加入的异甘草素的浓度逐渐增加,成浓度依赖性的降低(p<0.05)。4.在单纯加入10ng/ml IL-1β后,Bcl-2表达明显降低(p<0.05),但随着加入的异甘草素的浓度逐渐增加,成浓度依赖性的增加(p<0.05)。与Bcl-2相反,促进细胞凋亡的Bax基因在加入10ng/ml IL-1β后表达量明显升高(p<0.05),但随着加入的异甘草素的浓度逐渐增加,成浓度依赖性的降低(p<0.05)。Casepase-3及Casepase-9的表达在各组之间并没有明显变化(p>0.05),但Cleaved-Casepase-3和Cleaved-Casepase-9作为促进细胞凋亡的活性成分,在单纯加入10ng/ml IL-1β后明显升高(p<0.05),随着加入的异甘草素的浓度逐渐增加,成浓度依赖性的降低。NFκBp65的表达各组之间并没有明显的变化(p>0.05),但磷酸化的NFκBp65(p-p65)在单纯加入10ng/ml IL-1β后明显升高(p<0.05),随着加入的异甘草素的浓度逐渐增加,成浓度依赖性的降低(p<0.05)。(2)异甘草素对早期骨关节炎软骨下骨中RANKL-RANK-TRAF6信号通路及TGF-β1的影响:1.前交叉韧带切除术后30天,60天我们安乐死小鼠,进行初期的番红-固绿染色,发现模型组在两个时间点软骨都有明确的蛋白聚糖的丢失和软骨面的破坏,而治疗组明显预防了软骨内蛋白聚糖的丢失和软骨面的破坏。基于番红-固绿的国际骨关节炎协会(Osteoarthritis Research Society International)改良版评分也同样提示,治疗组与安慰剂组相比,评分明显改善(p<0.05),且与假手术组没有统计学差异(p>0.05)。HE染色结果提示,在造模术后60天,安慰剂组的钙化软骨明显增厚超过透明软骨(p<0.05),而治疗组与安慰剂组相比降低了钙化软骨的厚度(p<0.05)。免疫组织化学染色及荧光染色结果提示,模型组lubricin表达明显减少(p<0.05),而在治疗组可以看到异甘草素保留了软骨内的lubricin(p<0.05)。MMP-13及代表软骨降解的Ⅹ型胶原在模型组明显高表达(p<0.05),并与假手术组有统计学意义,而在异甘草素治疗组表达明显下降(p<0.05)。2.术后30天及60天的结果提示,安慰剂组BV/TV(%)在术后30天,60天都有明显的下降(p<0.05),而异甘草素治疗组保留了软骨下骨的骨量(p<0.05)。另外,和安慰剂组相比,异甘草素降低了骨小梁模式因子(p<0.05),增加了软骨下骨板的厚度(p<0.05),这些指标与假手术组相比没有明显的统计学差异(p>0.05)。安慰剂组软骨下骨髓腔内TRAP+的破骨细胞明显增多,这与Micro-CT结果相一致。而异甘草素治疗组明显降低了TRAP+的破骨细胞。同时,我们观察到安慰剂组Osterix阳性细胞数量明显增加(p<0.05)且聚在软骨下骨骨髓腔,而并没有迁移到骨吸收部位去偶联骨吸收。而异甘草素治疗组减少了髓腔内的Osterix阳性细胞(p<0.05)并可以看到少有的Osterix阳性位于骨形成的边缘并未位于髓腔内。在安慰剂组中,RANKL及TRAF6在软骨髓腔内共表达明显升高(p<0.05),而这一升高被异甘草素所抑制,并与假手术组并没有明显差异(p>0.05)。ELISA测定了小鼠外周血中破骨细胞骨吸收的标记物CTXⅠ,发现三组之间该指标并没有明显的差异(p>0.05)。3.安慰剂组中的nestin+间充质干细胞明显增多(p<0.05),而异甘草素降低了nestin+间充质干细胞的表达,并与假手术组没有明显的差异。在安慰剂组中,p Smad2/3阳性的细胞明显增多(p<0.05)。而异甘草素明显降低了这种异常高表达的p Smad2/3(p<0.05)。我们对小鼠0天,7天,14天,30天的样本进行免疫组织化学染色,发现p Smad2/3阳性的细胞与TRAP+破骨细胞的变化趋势相一致。(3)基于RANKL-RANK-TRAF6信号通路探究异甘草素对早期骨关节炎软骨下骨异常血管形成的影响:1.Micro-CT扫描结果提示,在术后30天时,安慰剂组软骨下骨的血管数量及体积与假手术组相比明显增多(p<0.05),而异甘草素减低了这种异常增加的显微血管(p<0.05)。2.在安慰剂组中,CD3l+和Endomucin+共表达阳性明显增多(p<0.05),而异甘草素明显降低了CD3l+和Endomucin+的表达(p<0.05)。说明异甘草素对H型血管有明显的抑制作用。3.通过免疫荧光染色证实,在术后30天,安慰剂组中软骨下骨内MMP-2表达明显升高(p<0.05),但异甘草素降低了异常高表达的MMP-2并与假手术组相比,没有明显差异。结论:(1)1.异甘草素通过下调关节软骨细胞内的NF-κB通路,抑制了IL-1β刺激下软骨细胞的凋亡及降解。(2)异甘草素通过下调软骨下骨RANKL-RANK-TRAF6通路直接抑制TRAP+破骨细胞的分化,降低破骨细胞骨吸收,间接减少有活性的TGF-β1的释放,从而降低骨髓间充质干细胞内p Smad2/3通路的表达,阻止其异常的迁移及异位成骨,最终抑制异常的软骨下骨骨重建,维持软骨下骨的显微结构,保证了正常的应力分布从而保护上层的关节软骨。(3)异甘草素通过直接抑制MMP-2的表达,间接抑制TGF-β信号通路,从而降低异常显微血管的形成来调节软骨下骨的骨重塑,抑制异常的骨形成,维持软骨下骨的显微结构并最终缓解骨关节炎的发生。