背景脑血管疾病已成为目前危害我国中老年人身体健康和生命的主要疾病之一,在全球范围内,脑卒中是各国面临的重大公共卫生问题。当下,脑卒中已经成为导致人类死亡的第二大原因,与此同时还是第三大致残疾病,给社会与家庭都造成了极大的经济负担。在我国,脑卒中己经超过心血管疾病成为患病率、致死率、致残率最高的疾病。缺血性脑卒中是脑卒中的主要类型之一,我国每年新发卒中患者中,缺血性卒中患者超过70%。介入治疗是当下解决脑血管疾病的一个重要手段。颈总动脉作为介入治疗的主要手术通路之一以及颈总动脉本身的介入操作会造成颈总动脉内皮损伤。众所周知,动脉血管内皮损伤可引起血小板激活、炎性反应、局部或者全身的高凝状态甚至血管再狭窄等严重后果。修复因介入治疗导致的颈总动脉内皮损伤已成为临床亟需解决的问题和研究热点。外泌体是直径为40-100 nm,在各种体液中均分布的膜衍生囊泡,各种组织细胞在静息或激动的情况下都可以释放外泌体。外泌体是细胞自分泌和旁分泌的重要载体,在临床治疗中具有重要潜在应用价值。外泌体包含有蛋白质、m RNA、micro RNA(mi RNA)等,其中mi RNA具有多种作用,参与生命活动的各个环节,已经成为当下研究的热点。内皮祖细胞,也称为成血管细胞,是血管内皮细胞的前体细胞。有研究报道,内皮祖细胞外泌体对血管内皮损伤有修复作用。而内皮祖细胞外泌体对颈总动脉内皮损伤的修复作用和修复机制还有待进一步研究。目的(1)本研究计划采用C57BL/6小鼠作为研究对象,用C57BL/6小鼠构建颈总动脉内皮损伤的动物模型,明确内皮祖细胞外泌体对颈总动脉内皮损伤的修复作用。(2)探究内皮祖细胞外泌体所包含的成分(主要是micro RNA)对颈总动脉内皮损伤的修复机制。方法(1)细胞免疫荧光实验诱导分化的内皮祖细胞和原代培养的颈总动脉内皮细胞,分别孵育相应的一抗:CD133、Fl K-1和FactorⅧ、VEGF,然后孵育二抗,荧光显微镜下拍照。(2)透射电镜拍照将新鲜提取的内皮祖细胞外泌体,置于透射电镜下观察外泌体的直径和形态。(3)蛋白质免疫印迹实验将新鲜提取的内皮祖细胞外泌体经过裂解制样、电泳、转膜、曝光,检测CD9、CD63、CD81蛋白。(4)内皮祖细胞外泌体mi RNAs高通量测序将新鲜提取的内皮祖细胞外泌体,委托公司进行建库和上机测序后,得到原始数据;后期自己进行数据过滤和差异聚类分析,以及总表达量分析、靶基因预测和KEGG分析。(5)细胞划痕实验将颈总动脉内皮细胞给予内皮祖细胞外泌体处理,0时和12小时时拍照,分析细胞的增殖和迁移能力的改变情况。(6)血管张力实验分别将颈总动脉内皮损伤模型组小鼠和损伤后给予内皮祖细胞外泌体组小鼠处死,取出颈总动脉进行血管张力实验,检测内皮依赖性舒张和内皮非依赖性舒张的改变情况。(7)免疫组化实验分别将颈总动脉内皮损伤模型组小鼠和损伤后给予内皮祖细胞外泌体组小鼠处死,取出颈总动脉进行免疫组化实验,检测内皮层VEGF表达量的改变情况。结果(1)免疫荧光实验结果显示,诱导分化得到的内皮祖细胞蛋白标记:CD133、Fl K-1强阳性;内皮祖细胞外泌体电镜下呈现典型的“杯托”状,直径在40-100 nm之间,蛋白质免疫印迹结果有清晰的CD9、CD63、CD81条带;免疫荧光实验结果显示,原代培养的颈总动脉内皮细胞蛋白标记:FactorⅧ、VEGF呈强阳性。(2)内皮祖细胞外泌体mi RNAs高通量测序结果显示,内皮祖细胞外泌体富含micro RNA:mmu-mi R-146a-5p,并通过靶基因预测和KEGG分析,发现mmu-mi R-146a-5p可以作用于VEGF信号通路。(3)细胞划痕实验结果显示,内皮祖细胞外泌体可以显著增强颈总动脉内皮细胞的增殖和迁移能力;颈总动脉血管张力实验结果显示,内皮祖细胞外泌体可以显著改善损伤内皮的内皮依赖性舒张功能;免疫组化结果显示,给予内皮祖细胞外泌体可以显著提高模型组小鼠颈总动脉内皮层VEGF的表达量。结论(1)内皮祖细胞外泌体可以促进颈总动脉内皮细胞的增殖以及上调内皮细胞的功能,修复颈总动脉内皮损伤。(2)内皮祖细胞外泌体对颈总动脉内皮损伤的相关机制可能是其包含的micro RNA:mmu-mi R-146a-5p,被颈总动脉内皮细胞摄取后激活VEGF信号通路,促进颈总动脉内皮损伤的修复。