目的:长QT综合征（Long QT syndrome,LQTS）是一种遗传性或者获得性疾病,临床上表现为心脏功能紊乱,动作电位时程延长,心电图QT间期延长,会出现不定期反复性晕厥、癫痫、心律失常、猝死等症状,但心脏结构没有异常改变。通过对大量的LQTS病人的临床研究表明,钙离子通道、钾离子通道、钠离子通道,钙调蛋白（calmodulin,CaM）等基因突变都会引起LQTS。尤其是CaM突变导致的LQTS是近年来的新发现,CaM由三个不同的基因（CALM1,CALM2,CALM3）编码,其中任何一个基因发生突变都可导致LQTS。CaM是一种重要的钙离子(Ca²⁺)感受器,与Ca²⁺结合后形成Ca²⁺/CaM复合物发挥信号转导等生理作用,对很多细胞功能、酶体系、心肌离子通道（Ca_V1.2钙通道,Na_V1.5钠通道,K_V1.5钾通道）和兰尼碱受体（ryanodine receptor 2,RyR2）等活性都有重要的调节作用,也参与肿瘤细胞的生长增殖和对多种药物的受体发挥诱导干预作用。CaM基因突变后,与Ca²⁺结合能力减弱或者丧失,影响对钙离子通道的调节,因此这些突变体常被用来研究LQTS的发病机制和钙通道的Ca²⁺相关性调节机制。心肌细胞中主要表达L型钙离子通道（L-type calcium channel,LTCC）,LTCC控制细胞Ca²⁺对膜电位变化的反应,调节心肌动作电位的发生、激素的分泌、神经递质的分泌和释放、兴奋收缩偶联等过程。LTCC由α₁、β、α/δ、γ四个亚基组成,其中α₁亚基是主要功能单位,α₁亚基根据氨基酸序列分为Ca_V1.1、Ca_V1.2、Ca_V1.3、Ca_V1.4通道,其中Ca_V1.2通道是Ca²⁺进入心肌细胞的主要途径。Ca_V1.2通道C末端和N末端是CaM结合位点,与CaM的相互作用参与Ca²⁺依赖性易化(Ca²⁺-dependent facilitation,CDF)和Ca²⁺依赖性失活(Ca²⁺-dependent inactivation,CDI)的调节过程。CDF和CDI过程都需要Ca²⁺/CaM的参与,Ca²⁺/CaM复合物与Ca_V1.2通道相互作用控制钙通道的开放与关闭,通过控制Ca²⁺的进入调控诸多生理和病理过程。CaM基因发生突变会改变基因表达导致多种疾病的发生,如LQTS、儿茶酚胺介导的多形性室速（Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia,CPVT）、心律失常、心肌肥厚、原发性心室纤颤、猝死等。已知与LQTS相关的CaM突变体会抑制CaM与Ca²⁺的结合,减弱Ca_V1.2钙通道的CDI作用,最终导致心脏功能紊乱,动作电位去极化延长,心电图显示QT间期延长,临床上表现为LQTS。据报道,LQTS相关的CaM基因突变有E141G、F142L、D130V、D130G、D96V等,其中E141G是一个关键的突变位点,因为CaM-E141G是目前被发现的第一个既异常调节成年人Na_V1.5钠通道又影响Ca_V1.2钙通道功能的突变体,而其他突变位点一般只会影响Ca_V1.2钙通道和婴幼儿的Na_V1.5钠通道的调节功能,并不阻碍成年人Na_V1.5钠通道的正常调节。无论是在婴幼儿还是成年人中,CaM-E141G都影响Ca_V1.2钙通道的功能,因此我们将研究突变体与钙通道之间的关系。在以往的研究中,关注点都在CaM突变体与Ca²⁺的亲和力变化上,其与Ca_V1.2钙通道的相互作用的变化情况以及单通道水平上的电生理影响目前尚不清楚。随着生物技术和多肽合成技术的日益成熟,越来越多的多肽药物被应用到临床研究中,它具有不良反应小,安全性高和易合成等特点,主要用于治疗癌症、肿瘤、代谢功能紊乱、心血管系统疾病等。基于以上特点,我们也尝试利用多肽修复CaM突变体引起的QT间期延长。本课题选取CaM-E141G和Ca_V1.2钙通道为研究对象,利用GST pull-down技术、电生理膜片钳技术、Langendorff心脏体外灌流技术和整体动物模型实验技术,探索CaM突变体与Ca_V1.2钙通道结合的变化以及对通道的电生理特性异常调节作用机制,并且构建了新型多肽,用于修复CaM突变体引起的心电图QT间期延长,为CaM与心血管系统疾病关系的进一步探索提供一定的理论依据。方法:利用定点突变技术将野生型CaM突变为CaM-E141G,应用GST pull-down实验来探索CaM-E141G与Ca_V1.2钙通道（CT1,PreIQ-IQ,PreIQ,IQ,NT）的相互作用,并与CaM-WT进行比较,观察突变体与Ca_V1.2钙通道结合情况的变化以及突变体对钙通道上不同基序的影响程度,分析CaM-E141G在Ca_V1.2钙通道上的主要异常调节基序片段;利用电生理膜片钳（inside-out模式）技术研究CaM-E141G对Ca_V1.2钙通道的电生理学影响,在静息状态和高Ca²⁺浓度下分析通道活性的变化以及通道开放和关闭特性的变化,分析CaM-E141G诱导的新的CDI机制;根据CaM/Ca²⁺与Ca_V1.2钙通道的结合位点及功能调节相关的氨基酸序列,设计并应用固相合成法合成CaM-WT和CaM-E141G来源的新型多肽CM4-R和CM4,然后,利用Langendorff心脏体外灌流技术探究多肽CM4对动物体外心脏心电图的影响,检测相关心电参数的变化,在mRNA水平上观察相关心肌蛋白的表达变化以及CM4-R的修复作用。进行整体动物模型实验,探究多肽CM4对动物在体心电图的影响,检测相关心电参数的变化,观察相关心肌蛋白的表达变化以及CM4-R的修复作用。结果:1、CaM-E141G与Ca_V1.2钙通道的结合作用。GST pull-down实验结果显示:CaM-E141G与Ca_V1.2钙通道具有结合能力,且结合具有蛋白浓度依赖性和Ca²⁺浓度依赖性。与CaM-WT相比,在高Ca²⁺浓度下,CaM-E141G与CT1、PreIQ-IQ、PreIQ、IQ和NT的结合显著减弱,最大结合量(B_max)降低了17.71-59.26%;且CaM-E141G对Ca_V1.2钙通道结合的亲和力也降低了,尤其是在与NT、PreIQ和IQ三个蛋白片段结合作用时,结合特性发生了显著变化。2、CaM-E141G对Ca_V1.2钙通道的电生理作用。膜片钳实验结果显示:在Ca²⁺浓度500 nM时,Ca²⁺/CaM-E141G对Ca_V1.2钙通道活性的抑制作用减弱了57.77%,使通道活性增加,抑制了CDI的过程;通道的开放和关闭时间也发生了变化:与CaM-WT相比,CaM-E141G不改变Ca_V1.2钙通道的快速开放时间,快速关闭时间从1.35±0.09 ms降低到了1.03±0.09 ms（P<0.05,n=5）;慢速开放时间从4.60±0.72 ms延长到了7.69±0.45 ms（P<0.01,n=5）,慢速关闭时间无变化,但关闭的通道数显著降低。这些结果表明,在500 nM Ca²⁺时,CaM-E141G使Ca_V1.2通道的门控开放时间延长,Ca²⁺依赖性失活减弱。3、CaM-E141G来源的多肽CM4对豚鼠离体心脏心电图QT间期的影响及多肽CM4-R的修复作用。Langendorff心脏体外灌流心电图监测结果显示:与Control组（n=4）相比,在CM4组（n=9）中,心电图QT间期显著延长（P<0.01）,伴随室性心律失常的发生（55.56%）;在CM4-R组（n=6）和CM4+CM4-R组（n=6）中,QT间期无显著性差异。结果表明,CM4引起的QT间期延长,多肽CM4-R对此有一定的修复作用。4、多肽CM4对Langendorff心脏体外灌流实验中不同组的心肌CaM、CaMKII和Ca_V1.2 mRNA表达的影响及多肽CM4-R的修复作用。qRT-PCR检测不同组心肌组织中CaM和CaMKII的mRNA表达,结果显示:CM4组（n=9）中CaM的mRNA表达明显低于Control组（0.9%NaCl）（P<0.01,n=4）、CM4+CM4-R组（P<0.05,n=6）和CM4-R组（P<0.05,n=6）;CM4组中CaMKII的mRNA表达明显低于对照组（P<0.05）。与Control组相比,CM4+CM4-R组和CM4-R组中CaM和CaMKII的mRNA表达无统计学差异。结果表明在mRNA水平,CM4降低了CaM和CaMKII的表达,同时CM4-R对这种异常有一定的修复作用。qRT-PCR检测不同组心肌组织中Ca_V1.2的mRNA表达,结果显示:与Control组相比,CM4组、CM4+CM4-R组、CM4-R组中Ca_V1.2 mRNA表达无统计学差异,表明CM4和CM4-R不影响Ca_V1.2的mRNA表达。5、CaM-E141G来源的多肽CM4对小鼠在体心电图QT间期的影响及多肽CM4-R的修复作用。小鼠在体心电图测试结果显示:与Control组相比（0.9%NaCl,n=14）,CM4组（n=6）中小鼠心电图QT间期显著延长（P<0.01）;CM4+CM4-R组（n=8）和CM4-R组（n=7）心电图QT间期无显著性差异。说明多肽CM4致使QT间期延长,CM4-R对此有一定的修复作用。6、多肽CM4对整体动物模型实验中不同组的心肌CaM和Ca_V1.2蛋白表达的影响及CM4-R的修复作用。Western blot检测不同组心肌组织中CaM的蛋白表达,结果显示:与Control组相比（0.9%NaCl,n=14）,CM4组（n=6）中CaM蛋白表达明显降低（P<0.05）;CM4-R组（n=7）和CM4-R+CM4组（n=8）中CaM的蛋白表达无统计学差异。说明CM4下调CaM蛋白的表达,CM4-R对该改变有一定的修复作用。Western blot检测不同组心肌组织中Ca_V1.2的蛋白表达,结果显示:与Control组相比（0.9%NaCl,n=14）,CM4组（n=6）、CM4-R组（n=7）和CM4-R+CM4组（n=8）中Ca_V1.2α₁亚基的蛋白表达均无统计学差异,提示CM4和CM4-R不影响Ca_V1.2蛋白的表达。结论:1、CaM的第141位氨基酸发生突变后降低与Ca_V1.2钙通道的结合作用,尤其与Ca_V1.2钙通道的PreIQ、IQ、NT蛋白片段的结合特性发生了显著变化。2、CaM-E141G在500 nM Ca²⁺浓度时,改变了Ca_V1.2钙通道的开放和关闭时间,使通道的活性增加,表明其Ca²⁺依赖性失活（CDI）减弱。3、CaM-E141G来源的多肽CM4使豚鼠离体心脏心电图QT间期延长,下调心肌CaM、CaMKII的mRNA表达,CM4-R对此有修复作用;4、CaM-E141G来源的多肽CM4可以诱导小鼠在体QT间期延长,下调心肌CaM的蛋白表达,CM4-R对此有修复作用。