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谷胱甘肽S-转移酶(GST, EC 2.5.1.18)是一类具有多功能活性的超家族蛋白酶,普遍存在于目前所发现的生物体内,具有细胞内化合物的解毒作用。拟南芥Zeta类谷胱甘肽S-转移酶(AtGSTZ)对于自来水中的强致癌物质二氯乙酸(DCA)具有专一性的降解功能,因此成为自来水生物处理上的得力助手。AtGSTZ活性的提高也成为生物学上的研究重点。在之前的AtGSTZ活性位点研究中,73位的丝氨酸(Ser73)被发现有特殊的性质。因此本文对此位点进行了详细地研究。Ser73是AtGSTZ的底物GSH结合区域(G-site)一个保守的位点,有研究表明此位点在其他家族GSTs中的同源位点与酶的各种性质密切相关,但是AtGSTZ与其他家族GST的同源性比较低,且此位点无人做过相关研究。
本文对AtGSTZ Ser73进行了点饱和突变,在目的位点处设计兼并引物,通过重叠延伸PCR构建点饱和突变文库。经过菌落PCR、质粒PCR及双酶切筛选,对所得的阳性突变子进行测序,获得了全部19种天然氨基酸残基替代的突变子。然后对各突变子的DCA脱氯(DCA-DC)活性、酶动力学参数、热稳定性及复性能力进行测定和分析,研究Ser73的结构.功能关系,为AtGSTZ的定向进化提供有用信息。DCA-DC活性测定结果显示,只有S73T、S73A和S73G分别保留了43.48％、21.62％和2.35％的野生型活力,其他突变子的活性均小于野生型的2％,说明73位氨基酸对突变呈现较低耐受性,分析发现这种低耐受性同AtGSTZ紧凑的G-site结构密切相关,紧凑的G-site结构阻止了长侧链氨基酸的进入,降低了突变子的催化活性。由动力学参数测定结果发现,突变酶S73T、S73A及S73G与野生酶相比,对底物GSH和DCA的亲和力及催化效率都明显降低,说明Ser73与GSH及DCA的结合及催化密切相关。热稳定性和复性能力分析表明,Ser73赋予了AtGSTZ更高的热稳定性和复性能力,说明Set73在AtGSTZ结构稳定和折叠动力学过程中起到了重要的作用。Ser73的这些特性具有一定的意义,为定向改造AtGSTZ酶提供了有用信息。