纤维堆囊菌合成埃博霉素几个关键问题的研究

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粘细菌是一类以滑动方式运动,可以形成种类丰富、功能多样的生物学活性物质,具有复杂多细胞社会学行为的革兰氏阴性杆菌。粘细菌所具有的社会学行为以及能够分化形成子实体结构的能力是区别于其他原核生物的主要特点。纤维堆囊菌是粘细菌中一类能够降解纤维素的生理类群,具有极其优异的生物学合成能力,发现由其产生的的次级代谢生物学活性物质占到了从粘细菌中总发现量的48.4%。纤维堆囊菌的社会性行为表现为在生长过程中呈现出聚团生长和细胞密度依赖性的特点,再加上纤维堆囊菌代时长达16小时,生长缓慢,这些特性严重限制了纤维堆囊菌的分离纯化工作,如纤维堆囊菌埃博霉素生物合成改造后期突变株的分离纯化。在本文的工作中,我们以纤维堆囊菌为研究对象,在山东大学粘细菌与医药微生物技术实验室建立的微包埋培养技术基础上将分散至单细胞状态的纤维堆囊菌单细胞包埋在海藻酸锶凝胶球粒中,实现了对单个纤维堆囊菌细胞的包埋。我们以被包埋的纤维堆囊菌菌株自身作为助长菌株,对实验室前期得到的埃博霉素诱变株进行包埋纯化。最终我们得到了具备突变株遗传特性的、埃博霉素产量存在显著差异的多个单克隆。微包埋技术克服了传统的分离纯化纤维堆囊菌效率低、耗时长的弊端,大大加快了纤维堆囊菌次级代谢途径改造的工作进程,提高工作效率。埃博霉素是纤维堆囊菌合成的一类具有促微管聚合活性的大环内酯类化合物,由于其抗肿瘤活性成为人们研究的热点之一。目前有多种埃博霉素类似物进入临床评估阶段,其中Ixabepilonelaos已经在美国成功上市。但是由于纤维堆囊菌埃博霉素产量低,价格昂贵等因素制约了埃博霉素的生产,树脂就是其中一个重要因素。目前不论是小型实验还是上罐发酵所用的埃博霉素吸附树脂都是美国罗门哈斯进口的XAD-16大孔吸附树脂,这种树脂价格昂贵,用量较大,提高了埃博霉素的生产成本。本文分析了40种不同类型的国产吸附树脂对纤维堆囊菌So0157-2产埃博霉素的影响,结果显示其中4种可以提高埃博霉素的产量,一种可以显著促进菌体的生长。复合树脂实验则证明不同优势树脂混合使用的效果远大于单一树脂,其中大孔型强碱阴离子交换树脂D202与大孔吸附树脂XD-5以3:7比例混合使用效果最佳,可以使So0157-2的埃博霉素产量较XAD-16提高8.3倍。天然的埃博霉素主要以埃博霉素A和埃博霉素B两种形式存在,我们把产生埃博霉素的菌株根据其epothioneA/B合成比例情况分为epo B+和epoB-两个种类。通过比较10株纤维堆囊菌的ATmodC2核酸、氨基酸序列信息及同源建模蛋白质3D结构水平的差异,找出四个可能会对ATmodC2底物选择造成差异的氨基酸位点(Val90,Ala91,Ala95,Ser196),这四个氨基酸位点在空间分布上均位于活性反应中心Ser94及Arg119的附近。我们将这四个氨基酸位点突变为Leu90,Val91,Ile95,Phe196,并进行ATmodC2的E.coli异源表达及包涵体蛋白复性。ATmodC2酶活测定结果表明,这4个氨基酸位点的改变造成ATmodC2对methylmalony-CoA的结合能力降低了近80%。而单一位点突变的M95,M196反应后MM/M为别为0.58和0.30,说明突变子结合甲基丙二酰辅酶A的能力分别下降至结合丙二酰辅酶A的58%和30%,从这个结果我们可以看到196位点Ser替换为Phe后对甲基丙二酰辅酶A的结合能力影响很大。实验室前期工作中提出的2个新位点90,91联合突变子M90-91的MM/M值为0.35,说明这两个位点对于甲基丙二酰辅酶A的结合确实有一定的影响,且影响程度与95,196位联合突变子M95-196相当。
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