子宫肌瘤是育龄妇女最常见的良性肿瘤,患病率为30%至70%,其中,约三分之一的患者有临床症状,包括异常子宫出血（AUB）、贫血、骨盆压力和疼痛、痛经和生殖功能障碍。传统上认为症状的存在和严重程度取决于肌瘤（浆膜下、肌壁间或粘膜下）的大小和位置,但是现在大多数学者认为肌瘤生长速度、有无恶变才是导致子宫肌瘤症状严重的原因,而与肌瘤大小、数目多少关系相对较小。导致患者发生子宫肌瘤的因素主要为遗传因素,长期口服避孕药以及多次人工流产等。目前,临床上治疗子宫肌瘤主要采用手术治疗与药物治疗,至今为止,尚未发现一种治疗效果理想且副作用小的治疗药物,因此在实际临床治疗过程中仍以手术治疗为主。但是,手术治疗将严重影响患者的生活质量。因此,寻找并开发更有效的治疗靶点,才是理想的治疗子宫肌瘤的方式。上皮间充质转化（EMT）在子宫肌瘤的侵袭和转移中起着至关重要的作用。E-钙粘蛋白（E-cadherin）是钙粘附蛋白家族成员之一,其表达缺失或减少可促进细胞迁移和侵袭。E-钙粘蛋白是上皮表型细胞的标记分子,对维持细胞极性具有重要价值;N-cadherin和Vimentin是间质表型细胞的标记分子,可促进细胞运动和侵袭;Snail是一种调节EMT过程的转录因子,它与E-cadherin启动子区域结合,阻碍基因转录,削弱上皮表型并促进其转化为间质表型。因此,抑制EMT对子宫肌瘤的侵袭起到重要作用。信号转导及转录激活因子（STAT）是一种能与DNA结合的蛋白质独特家族。含有SH2和SH3结构域,可与特定的含磷酸化酪氨酸的肽段结合。当STAT被磷酸化后,发生聚合成为同源或异源二聚体形式的活化的转录激活因子,进入胞核内与靶基因启动子序列的特定位点结合,促进其转录。STAT3是介导癌基因细胞转化所必需的,与人类癌症直接相关。激活的STAT3可进一步刺激c-Myc、VEGF、MMPs和其他分子,促进肿瘤细胞增殖、侵袭、转移和血管生成。我们研究表明,STAT3可以增加细胞周期蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达,并促进子宫肌瘤细胞的增殖。此外,STAT3信号通路通过增加MMP2和MMP9的表达,从而增强子宫肌瘤细胞的侵袭。提示:STAT3信号通路在子宫肌瘤的发生发展中起着重要作用。miRNA可以降解或抑制mRNA翻译,从而参与细胞增殖、凋亡和侵袭的调节。miR-29家族由miR-29a、miR-29b和miR-29c组成。miR-29家族可以作为肿瘤抑制因子,抑制胃癌、肺癌、肝癌和结肠癌的增殖。据报道,miR-29a可以通过NF-κB和Wnt/β-catenin信号通路调节BMI1基因的表达,从而抑制肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭功能。miR-29a可以靶向CDK6并下调JNK和p38/MAPK/ERK信号通路,从而抑制神经鞘瘤的增殖。miR-29b在宫颈癌中受到抑制,从而促进了细胞外基质积累和细胞增殖率。miR-29b在头颈部鳞状细胞癌中表达下调,并通过阻断整合素β1介导的癌基因信号通路发挥肿瘤抑制作用。根据Liu的研究,miR-29b调节肺腺癌细胞中的STAT3,STAT3可以促进肺腺癌细胞增殖,同时抑制凋亡。针对miR-29c的研究相对来说比较少,有研究者认为miR-29c在不同肿瘤的差异表达,可能为肿瘤的靶向治疗提供可能。我们利用miRNA的高通量测序和恰当的基础实验证明:当miR-29c过度表达时,它与STAT3结合,导致STAT3降解。随后,细胞周期蛋白Cyclin D1和c-Myc的表达降低,子宫肌瘤细胞的增殖受到抑制。此外,STAT3被确定为MMP2和MMP9表达的必要介质,STAT3直接激活癌细胞中MMP2和MMP9的转录。当STAT3被miR-29c调控降解时,MMP2和MMP9表达减少,子宫肌瘤的转移和侵袭减弱。miR-29c在肿瘤细胞中表达下调,降低干细胞相关转录因子的表达及其形成小球的能力,激活STAT3信号通路,提高STAT3表达,促进肿瘤发病。因此,miR-29c与STAT3的相互作用,在细胞外基质降解、增强肿瘤侵袭、增殖和转移等方面发挥关键作用。研究结果提示:miR-29c的高表达可以抑制子宫肌瘤细胞的增殖、侵袭和转移,这可能与抑制STAT3信号通路有关,为子宫肌瘤的诊断和治疗提供了新的靶点。尽管本研究进行了严格的miRNA测序分析,但仍存在一些不足,没有进行基因过度表达或敲除的动物实验来进一步验证。在未来的研究中,我们会对这方面进行深入探讨。临床对子宫肌瘤的诊断和观察绝大多数靠超声来实现。我们对子宫动脉各种超声指标进行了收集和统计分析,结果表明,子宫肌瘤患者的子宫动脉血供丰富,超声指标S/D低于对照组人群,对子宫肌瘤的观察和治疗提供了一个观察指标的新选择。第一部分子宫肌瘤中差异蛋白和miRNA的筛选目的:通过检测子宫肌瘤和子宫肌层样本中差异表达的miRNA,筛选出调控子宫肌瘤的核心miRNA,并通过基础实验进一步明确。方法:1.使用R语言limma软件包对RNA-seq数据进行分位数标准化处理并进行差异基因分析（|log FC|＜1,p-value＜0.05）,同时进行聚类分析。2.将术中获取的组织块剪碎（大约剪成体积为1mm~3）并均质后,以含青霉素和链霉素的磷酸缓冲液洗涤2-3次。将组织置于1mg/ml的IV胶原酶中消化3-5h。通过100um细胞过滤器成功过滤细胞去除杂质。然后,将细胞离心（1500rpm/5min）,收集沉淀物并悬浮在DMEM培养基中。子宫肌瘤细胞培养期间,通过显微镜观察子宫肌瘤细胞状态,待长满后,进行细胞传代,实验所用细胞为第三代细胞。分别收集子宫肌瘤细胞和子宫肌层细胞,提取全细胞RNA。通过RT-PCR检测比较miR-29c的mRNA水平。3.将子宫相关肿瘤细胞系（Hela,HT-3,Ect1/E6E7,HTP6136）,培养传代,直到第三代细胞被收集,提取全细胞RNA。通过RT-PCR检测比较miR-29c的mRNA水平。4.提取并培养子宫肌瘤细胞和子宫肌层细胞,直到第三代细胞被收集,提取全细胞蛋白。通过Western blot技术分析肿瘤迁移相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、snail）,侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）,增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）的表达变化。5.提取并培养子宫肌瘤细胞和子宫肌层细胞,直到第三代细胞被收集,提取全细胞RNA。通过RT-PCR技术分析肿瘤迁移相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、snail）,侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）,增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）的mRNA表达变化。结果:1.差异表达基因的筛选:按p-value＜0.05和|log FC|＜1标准对子宫肌瘤miRNA测序结果进行筛选,结果得到子宫肌瘤的miRNA中差异表达基因共有204个,其中上调有139个,下调的有65个。其中,miR-29c在子宫肌瘤中显著降低,结果提示:miR-29c在子宫肌瘤中可能处于基因调控的核心地位。2.与子宫肌层组织相比,miR-29c在子宫肌瘤组织中显著低表达。3.相对于子宫部位的其他肿瘤细胞系而言,在子宫肌瘤细胞系HTP6136中,miR-29c表达最低,而且是显著降低。4.在子宫肌瘤中,无论是蛋白水平还是基因水平,E-cadherin表达均降低,而其他的迁移相关蛋白N-cadherin、Vimentin、snail均显著增高。5.在子宫肌瘤中,无论是蛋白水平还是基因水平,侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）均显著增高。6.在子宫肌瘤中,无论是蛋白水平还是基因水平,增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）均显著增高。小结:1.基于miRNA测序分析,miR-29c在子宫肌瘤基因调控中处于核心地位。2.miR-29c在子宫肌瘤组织和细胞中均显著低表达。3.miR-29c可能调控子宫肌瘤细胞的迁移、侵袭和增殖。第二部分miR-29c对子宫肌瘤细胞迁移、侵袭和增殖的影响目的:利用分子生物学手段,明确miR-29c对子宫肌瘤的调控作用。方法:1.子宫肌瘤细胞接种至6孔板培养。实验分为（1）对照组（NC组）:转染miR-NC模拟物;（2）miR-29c组:转染miR-29c模拟物;（3）抑制剂NC组:转染miR-NC抑制剂;（4）抑制剂组:转染miR-29c抑制剂;每组设置4个平行复孔。等到子宫肌瘤细胞培养至融合度大约为80%时,按照脂质体转染试剂（Lipofectamine 3000）说明书步骤进行转染。48 h后,收集各组细胞,提取总RNA,通过RT-PCR法检测转染效果。2.重复上述方法1,收集细胞,提取总蛋白。通过Western blot法检测肿瘤迁移相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、snail）,侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）,增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）的表达变化。3.细胞侵袭实验:用无血清培养基稀释的基质凝胶涂在Transwell室内孔径为8μm的聚碳酸酯微孔膜上,并充分融合2小时。将细胞重新悬浮在无血清培养基中,并将细胞置于Transwell小室,放入24孔板中。在Transwell小室的下方加入500μl含血清培养基,在上小室中加入200μl细胞悬浮液,并培养24小时。检测子宫肌瘤细胞的侵袭能力。4.细胞增殖实验:将处于对数生长期的子宫肌瘤细胞用胰酶消化后,用完全培养基重悬成细胞悬液并计数,按400个/孔的密度将细胞接种于六孔板中培养至大多数单个克隆株中的细胞数大于50个为止,中间每隔3天进行换液并观察细胞状态,克隆完成后用PBS洗涤一次,4%多聚甲醛固定30min,PBS洗涤后每孔加入0.1%结晶紫染液,对细胞染色10-20min,PBS洗涤2-3次,晾干后数码相机拍照。检测子宫肌瘤细胞的增殖能力。结果:1.在子宫肌瘤细胞中,与转染miR-NC对照组相比较,转染miR-29c模拟物的子宫肌瘤细胞,miR-29c的mRNA水平将明显升高;转染miR-29c抑制剂的子宫肌瘤细胞,miR-29c的mRNA水平将明显降低。2.在子宫肌瘤细胞中,与转染miR-NC对照组相比较,子宫肌瘤细胞转染miR-29c模拟物后,E-cadherin蛋白表达升高,而其他的迁移相关蛋白N-cadherin、Vimentin、snail均显著降低;转染miR-29c抑制剂后,E-cadherin蛋白表达降低,而其他的迁移相关蛋白N-cadherin、Vimentin、snail均显著增高。3.在子宫肌瘤细胞中,与转染miR-NC对照组相比较,子宫肌瘤细胞转染miR-29c模拟物后,侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）表达降低;转染miR-29c抑制剂后,侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）表达显著增高。4.在子宫肌瘤细胞中,与转染miR-NC对照组相比较,子宫肌瘤细胞转染miR-29c模拟物后,增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）表达降低;转染miR-29c抑制剂后,增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）表达显著增高。5.细胞侵袭实验结果显示:与转染miR-NC对照组相比较,子宫肌瘤细胞转染miR-29c模拟物后,侵袭能力明显降低;转染miR-29c抑制剂后,侵袭能力显著增高。6.细胞增殖实验结果显示:与转染miR-NC对照组相比较,子宫肌瘤细胞转染miR-29c模拟物后,增殖能力明显降低;转染miR-29c抑制剂后,增殖能力显著增高。小结:1.miR-29c通过改变E-cadherin、N-cadherin、Vimentin以及Snail的表达,而影响子宫肌瘤的迁移。2.miR-29c通过改变MMP2、MMP9的表达,而影响子宫肌瘤的侵袭。3.miR-29c通过改变Cyclin D1、c-Myc的表达,而影响子宫肌瘤的增殖。第三部分miR-29c靶向STAT3调控子宫肌瘤的发生发展目的:利用分子生物学手段,明确miR-29c是靶向STAT3而调控子宫肌瘤的发生发展。方法:1.荧光素酶报告基因检测:构建STAT3的突变体:STAT3-MUT。分别转染miR-29c mimic至STAT3-WT子宫肌瘤细胞以及STAT3-MUT子宫肌瘤细胞。之后,按照Dual-Lumi?萤火虫萤光素酶检测试剂盒说明书进行操作,最后使用具有检测化学发光功能的多功能酶标仪检测萤火虫荧光素酶的荧光值。2.分离并培养子宫肌瘤细胞和子宫肌层细胞,进行细胞传代,至细胞为第三代细胞。分别提取全细胞RNA和蛋白。通过RT-PCR检测比较STAT3的mRNA水平,通过Western blot检测STAT3的蛋白表达水平。3.将子宫相关肿瘤细胞系（Hela,HT-3,Ect1/E6E7,HTP6136）,培养传代,直到第三代细胞被收集,提取全细胞RNA。通过RT-PCR检测比较STAT3的mRNA水平。4.在子宫肌瘤细胞中,转染miR-29c mimic,收集细胞,提取全蛋白,通过Western blot检测STAT3的蛋白表达水平。5.在子宫肌瘤细胞中,转染si-STAT3,收集细胞,提取全蛋白,通过Western blot检测肿瘤迁移相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、snail）,侵袭相关蛋白（MMP2、MMP9）,增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）的表达变化。结果:1.荧光素酶报告基因检测结果显示:在STAT3-WT的子宫肌瘤细胞中,转染miR-29c将降低荧光强度,但是在STAT3-MUT的子宫肌瘤细胞中,转染miR-29c荧光强度保持不变。2.Western blot和RT-PCR结果显示:在子宫肌瘤细胞中,STAT3的表达均升高。3.在子宫相关的癌症细胞系中,子宫肌瘤细胞系HTP6136中,STAT3的mRNA表达最高,而且是显著增高。4.在子宫肌瘤细胞中,转染si-STAT3后,Western blot检测肿瘤迁移相关蛋白E-cadherin显著升高,而N-cadherin、Vimentin、snail均显著减低。5.在子宫肌瘤细胞中,转染si-STAT3后,Western blot检测侵袭相关蛋白MMP2和MMP9均显著减低。6.在子宫肌瘤细胞中,转染si-STAT3后,Western blot检测增殖相关蛋白（Cyclin D1、c-Myc）均显著减低。小结:1.miR-29c的作用靶点是STAT3。2.miR-29c通过结合STAT3,导致STAT3降解,进而抑制子宫肌瘤的增殖、侵袭和迁移。第四部分超声监测子宫动脉对子宫肌瘤的临床特征分析目的:利用多普勒超声监测子宫动脉,分析子宫肌瘤的临床特征。方法:对临床上收集到的310例病例（20～60岁之间的女性）的子宫动脉超声指标进行分析,包括动脉收缩期峰值血流速度（PS）、舒张末期血流速度（ED）、动脉收缩期峰值血流速度/舒张末期血流速度（S/D）以及阻力指数（RI）,观察这些变量在不同年龄阶段和子宫肌瘤发病中的差异,以评估这些变量在子宫肌瘤诊断和治疗中的参考价值。结果:1.年龄在20-60岁之间的女性当中,子宫肌瘤发病率与年龄相关,30岁以下发病率极低,随年龄增长发病率逐渐升高。2.两侧子宫动脉的多普勒超声指标没有显著性差异。3.与正常对照组相比,子宫肌瘤组S/D显著降低。而对于不同子宫肌瘤大小,50mm以下组和50mm以上组,各指标并未有显著性差异。小结:1.在一定的年龄范围内,子宫肌瘤发病率与年龄呈正相关。2.左右两侧的子宫动脉超声指标没有差异。3.患有子宫肌瘤组与正常对照组子宫动脉超声指标S/D差异有显著性（P＜0.05）,肌瘤大小对子宫动脉指标没有相关性。结论:1.miR-29c在子宫肌瘤基因调控中处于核心地位。2.miR-29c在子宫肌瘤组织和细胞中均显著低表达。3.miR-29c的作用靶点是STAT3。4.miR-29c通过结合STAT3,导致STAT3降解,进而抑制子宫肌瘤的增殖、侵袭和迁移。5.子宫动脉超声指标与子宫肌瘤的发病呈相关性,子宫动脉超声指标亦可以作为选择治疗手段的参考。