弓形虫属于顶复门孢子虫纲,在宿主细胞内寄生生活,生殖方式包括无性生殖和有性生殖,生活史较复杂。人和动物对弓形虫均具有易感性,在宿主免疫低下时,可引起严重的弓形虫病。弓形虫是天然的嘌呤、鸟氨酸、精氨酸缺陷性虫株,必须从细胞内获取原料,以维持自身生长发育。弓形虫可独立合成尿苷酸。尿苷酸作为弓形虫其他嘧啶核苷酸合成的前体,可用于DNA和RNA合成,对弓形虫复制增殖具有重要作用,尿苷酸合成受限对虫体增殖、毒力均可产生影响。弓形虫尿苷酸合成包括从头合成途径和补救合成途径。氨基甲酰磷酸合成酶Ⅱ（CPSⅡ）是尿苷酸从头合成途径的第一个关键酶,包含谷氨酰胺氨基转移酶结构域、ATP结合结构域等多个亚单位,能转移谷氨酰胺的氨基和ATP的磷酸与CO2结合形成氨基甲酰磷酸。为探究CPSⅡ缺失对弓形虫生物学特性的影响,本课题构建了CPSⅡ基因缺失虫株,探究其在体内外的复制增殖能力及诱导小鼠产生的免疫效应。根据CRISPR技术原理,构建p SAG1::Cas9-U6::sg CPSⅡ基因敲除质粒。以p SAG1::Cas9-U6::sg UPRT为模板,利用点突变将质粒上的sg UPRT序列替换为靶向CPSⅡ的sg RNA序列。再以p UPRT::DHFR-D质粒为模板,PCR扩增带有同源臂的DHFR序列。将p SAG1::Cas9-U6::sg CPSⅡ质粒与DHFR序列共同电转至弓形虫速殖子,用抗性药物乙胺嘧啶筛选基因敲除成功的虫株。获得ΔCPSⅡ虫株后,分别将野生型虫株和ΔCPSⅡ株感染Vero细胞和BALB/c小鼠,探究CPSⅡ基因缺失对虫株的影响。体内外实验结果均表明,ΔCPSⅡ株的增殖速度较野生型虫株相比显著降低。将虫株感染细胞后,若在培养液中添加尿嘧啶,ΔCPSⅡ株能正常增殖及逸出,复制速度与野生型虫株接近一致;若不添加尿嘧啶,敲除株增殖速度明显减慢。将相同剂量的野生型虫株和ΔCPSⅡ株接种BALB/c小鼠腹腔,发现接种野生型虫株的小鼠的半数生存时间为4天,接种ΔCPSⅡ株小鼠的半数生存时间为10天,CPSⅡ敲除株能明显提高小鼠的免疫能力、延长小鼠生存时间。分别在感染后4天和10天收集小鼠腹水和肝组织,检测虫株在小鼠体内的增殖情况。结果发现,在感染后4天,注射ΔCPSⅡ株的小鼠腹水中未见虫体增殖,在肝组织中存在少量虫体增殖。在感染后10天,ΔCPSⅡ株大量繁殖,与感染后4天野生型虫株的增殖能力接近一致,说明ΔCPSⅡ株的增殖能力在感染早期受限,在感染后期恢复。对小鼠外周血进行细胞因子检测、免疫相关转录因子表达水平检测及白细胞计数,发现ΔCPSⅡ株可诱导小鼠IFN-γ、IL-12表达升高,间接说明ΔCPSⅡ株具有诱导宿主固有免疫和适应性免疫应答产生的能力,且转录因子之间的表达差异与细胞因子之间表达差异具有一致性。野生型虫株、ΔCPSⅡ株在感染后4天及10天均导致中性粒细胞显著性增多、淋巴细胞显著性减少,在感染后10天,敲除株诱导小鼠产生的中性粒细胞与淋巴细胞数绝对值、百分比与PBS对照组之间存在显著性差异,说明ΔCPSⅡ株可诱导明显的免疫细胞数量改变。弓形虫全虫感染通常会引起有效的Th1型细胞应答,但是本实验结果显示宿主淋巴细胞数明显减少,针对这一结果,我们推测:ΔCPSⅡ株在感染早期可诱导小鼠免疫应答产生,但效应程度不如RH株强烈;在感染后期,ΔCPSⅡ株恢复增殖能力、大量繁殖,产生抑制宿主免疫应答的作用,所以出现淋巴细胞数显著性下降、小鼠死亡的现象。尿苷酸是弓形虫生存繁殖的重要营养物质,尿苷酸缺失严重影响弓形虫的复制增殖能力及毒力。本研究发现,CPSⅡ基因缺失可使虫株的复制增殖速度减慢,但虫株没有完全失去增殖能力及毒力,可能是尿苷酸补救合成途径发挥了作用。弓形虫尿苷酸的合成机制目前尚未完全阐明,CPSⅡ基因缺失虫株的生物学特性还需进一步研究。然而,CPSⅡ基因缺失造成弓形虫尿苷酸营养缺陷,导致虫体增殖能力和毒力减弱,且具有诱导固有免疫及细胞免疫产生的特性,有望成为研制弓形虫减毒活疫苗的理想模型,可为长期、有效控制弓形虫感染提供理论和实验依据。