研究背景黑素细胞是一类特定的黑素生成细胞,其起源于外胚层的神经嵴,成熟的黑素细胞在脊椎生物体的皮肤、毛发、眼睛等的色素呈现中起着决定性作用。黑素细胞所生成的黑素过多、过少或缺乏可引起诸如白癜风、黄褐斑等多种色素障碍性皮肤病。所以,对于色素性疾病的基础和临床研究来说,有关黑素细胞的发育调控过程的研究是个提纲挈领的切入点。近年来随着各类干细胞生物学相关技术的不断成熟,进一步从干细胞的角度出发,探索黑素细胞前体阶段向成熟黑素细胞发育分化的过程和机制,对于探讨诸如白癜风之类的色素性疾病的发病机理,以及寻找新的治疗靶点,或许都将是个有益的尝试。近年来已有众多研究证实毛囊部外毛根部隆突区域存在神经嵴来源的多能成体干细胞,我们简称为毛囊部神经嵴干细胞(HF-NCSCs)。HF-NCSCs能进行自我更新,同时处于未分化的原始阶段,在一定条件下可分化成黑素细胞、感觉神经元、间质细胞等特定组织类型。因此,利用HF-NCSCs模型,有助于我们深入研究从神经嵴干细胞阶段→黑素前体细胞阶段(黑素干细胞—黑素母细胞)→黑素细胞阶段的发育分化过程和调控机制,为理解色素性疾病的发生、发展和恢复提供新的理论依据和新的思路。具体联系到临床,我们知道光疗(如NB-UVB)治疗白癜风皮损后,患者色素的恢复呈现典型的以毛囊为中心向四周扩展(点状型)的方式。这种复色过程的本质可能与HF-NCSCs向成熟MC细胞的分化发育密切相关。此外,我们注意到近年来涌现出的308nm准分子激光在临床应用中较NB-UVB治疗白癜风的疗效更为确切快捷。但是,尽管NB-UVB/308nm准分子激光临床疗效确切,相关的临床回顾性研究也较多,但有关NB-UVB以及308nm准分子激光治疗白癜风的机制方面的研究却少有报道,相关的治疗机理尚待进一步明确。研究目的本课题设想以HF-NCSCs为细胞模型,结合临床,拟开展有关NB-UVB以及308nm准分子激光对体外培养的HF-NCSCs向MC系定向分化的影响及相关机制的实验研究。研究方法HF-NCSCs取材于C57BL/6小鼠触须的外毛根鞘隆突区域,酶消化法得到单细胞悬液,置于神经嵴干细胞增殖培养基中培养。以RT-PCR来鉴定它们的神经嵴干细胞标志物的表达；以免疫荧光来检测在各种特定培养液诱导下各种定向分化的细胞所含的特异性抗体的表达,尤其是向MC定向分化的特异标志物的表达。接下来,我们以0.1-0.6J剂量范围内的NB-UVB或308nm准分子激光照射HF-NCSCs,并换用MC特定培养基培养一定时间后,依次评估对定向分化的黑素细胞系的细胞活性、分化能力和迁移能力的影响。我们用细胞计数的方法比较对HF-NCSCs分化的黑素细胞系的细胞活性的影响。用免疫荧光、多巴染色、络氨酸酶活性反应、Realtime-PCR和Western blot等多种方法检测NB-UVB对HF-NCSCs分化的MC系的细胞成熟度的影响。用Transwell小室检测NB-UVB对HF-NCSCs向MC系分化过程中的细胞迁移能力的影响。在进一步的有关NB-UVB对HF-NCSCs向MC系分化过程中调控机制的探讨方面,我们用Realtime-PCR检测NB-UVB对黑素细胞调控因子Mc1R、Kit、 Fzd4、NT3R、Ednra、EP1、TGFβR、Notch1、Sox10、Mitf, Lefl和Pax3等的表达变化；用Western blot检测Sox10、Mitf的蛋白表达变化；用Elisa检测了受NB-UVB照射后细胞上清液中SCF、α-MSH的含量。此外,我们进一步用cAMP-PKA信号通路的激动剂IBMX添加入培养液,观察其在NB-UVB对HF-NCSCs向MC系分化过程中的影响。在308nnm准分子激光和NB-UVB对HF-NCSCs向黑素细胞系定向分化过程的比较研究部分,我们同样用细胞计数的方法观察两组对HF-NCSCs分化的黑素细胞系的细胞活性的影响；用Realtime-PCR检测两组受照射后分化而来的黑素细胞Tyro、Tyrp1、Tyrp2等的表达差异；用Elisa和Realtime-PCR检测两组受照射后分化而来的MC系细胞上清液中SCF、α-MSH的含量,以及MclR、Kit、Sox10等的表达变化研究结果一、HF-NCSCs的培养鉴定及向黑素细胞系的定向分化从小鼠触须的毛囊隆突部位分离培养得到的HF-NCSCs以悬浮状态或贴壁状态呈克隆性生长。悬浮状态克隆性生长时,细胞形态显示为特征性的三维球体样结构。RT-PCR显示,它们表达多种NCSC特异性标志物如Nestin、p75、Sox10、 Snail-1、Twist-1等,一些皮肤组织来源的干细胞标志物如Myo10、Msx2,以及一些通用干细胞的标志物如Klf4和Wntl等。在特定培养液诱导下,HF-NCSCs均可以定向分化成黑素细胞、平滑肌细胞、神经元等多种细胞类型。在本课题主要关注的HF-NCSCs往黑素细胞系定向分化这条主线上,我们以HF-NCSC为种子细胞,经过1-2周的特定黑素细胞培养液的诱导培养,所得到的分化细胞呈现类似正常MC的双极树突或多极树突外观。更重要的是,部分分化细胞呈多巴反应阳性,并表达MC特异标志物Mitf、Tyro,表明所得到的分化细胞符合黑素细胞或黑素母细胞的相关特征。二、NB-UVB对HF-NCSCs向黑素细胞系定向分化的干预研究在0.1-0.6J剂量范围内,随着照射剂量增大,NB-UVB对HF-NCSCs分化的MC系细胞的增殖呈现抑制作用。在HF-NCSCs向MC系定向分化过程中细胞的成熟度方面,NB-UVB作用能逐渐增加由HF-NCSCs分化的MC系细胞的Tyro、 Tyrp1、Tyrp2等的表达。在HF-NCSCs向MC系定向分化过程中细胞迁移的影响方面,迁移试验表明由HF-NCSCs分化来的MC系细胞在小剂量NB-UVB作用下迁移能力无明显影响,剂量增大则迁移能力逐渐下降。而对于HF-NCSCs来说,NB-UVB则在一定剂量范围内能促进HF-NCSCs的迁移。三、NB-UVB对HF-NCSCs向黑素细胞系定向分化的机制研究进一步的机制研究表明,在NB-UVB作用影响下,由HF-NCSCs分化而来的MC系细胞的Mc1R、Kit、Fzd-4、EP-1、Sox10、Mitf等的表达,以及细胞上清液中SCF、α-MSH的含量均有不同程度的增加,其中以Mc1R、Kit、Sox10差异最为显著。此外,cAMP-PKA信号通路的激动剂IBMX添加入培养液后能促进NB-UVB照射后由HF-NCSCs分化而来的MC系细胞的成熟。四、308nm准分子激光和NB-UVB对HF-NCSCs向黑素细胞系定向分化的比较研究在相同剂量、相同时间范围内,308nm准分子激光较NB-UVB能更明显增加由HF-NCSCs分化而来的MC系细胞的Tyro、Tyrp1、Tyrp2等的表达。此外,308nm准分子激光作用组的细胞上清液中a-MSH的含量较NB-UVB组明显增高。研究结论一、HF-NCSCs来源丰富不受限,位置表浅易取材,多向分化运用广,伦理道德争议小,是比ES更理想的干细胞来源,是研究MC前体阶段发育分化及相关调控机制的理想细胞模型。二、NB-UVB在一定剂量范围内尽管随着剂量增加,由HF-NCSCs分化的MC系细胞的增殖呈现抑制趋势,但另一方面所得到的MC系细胞的功能在增强,表明了NB-UVB能直接有效地促进HF-NCSCs向成熟的MC细胞分化发育。在细胞迁移方面的影响上,NB-UVB在一定合适的剂量范围内可提高HF-NCSCs的迁移能力；而对于由HF-NCSCs分化来的MC系细胞,NB-UVB在小剂量作用下对其的迁移能力无明显影响,剂量增大由HF-NCSCs分化来的MC系细胞移能力则呈现逐渐下降。三、Mc1R、Kit、 Sox10以及cAMP-PKA信号通路等在NB-UVB促HF-NCSCs向成熟的MC分化发育中可能起主要的调控影响作用。四、在相同时间、相同剂量的作用下,308nm准分子激光较NB-UVB能更明显地促进由HF-NCSCs分化来的MC系细胞的成熟度。这些数据表明NB-UVB/308nm准分子激光在一定剂量范围内能直接促进HF-NCSCs向MC系细胞的分化成熟。这为解释白癜风患者皮损受NB-UVB/308nm准分子激光治疗后的复色过程以及相关复色机制提供了理论依据。