目的:脑卒中是常见的脑血管病之一,具有发病率高,致死率及致残率高的特点。尽管目前已有的溶栓疗法和新兴的血管内介入治疗可以在一定程度上开通闭塞的血管,如何有效的预防和治疗卒中后的缺血性脑损伤仍然是临床上的难点。小分子RNA（microRNA,miRNA）的长度大约在20-25个核苷酸左右,属于小的非蛋白编码RNA家族的一种。它们可与靶基因的mRNA相结合,然后导致mRNA降解或转录受到抑制。报道称在缺血后的脑组织内,有超过20%的miRNA表达发生变化,提示miRNA可能参与了脑卒中的发生和发展过程。近来,有研究发现一些miRNA可能对脑缺血性损伤具有保护作用。在许多中枢神经系统疾病中均发现了miR-532-5p的表达变化,如多发性硬化、肌萎缩侧索硬化及脑出血等。而在缺血性脑卒中患者的外周血中,发现miR-532-5p表达水平显著减低。但miR-532-5p在中枢神经系统疾病尤其是缺血性脑卒中具有什么作用目前尚不知晓。体外研究发现,高表达miR-532-5p抑制了缺氧后H9c2细胞的凋亡,是否miR-532-5p对缺氧后的脑损伤具有类似的保护作用目前仍不清楚。同源磷酸酶-张力蛋白基因（Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN）是被认为是一种癌症抑制因子,主要通过去磷酸化3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate,PIP3）,抑制PI3K/Akt信号通路的激活来发挥作用。已有研究证实PTEN与缺血性脑损伤过程的调节相关。同时,也有研究发现miR-532-5p也可通过影响PI3K/Akt信号通路对细胞凋亡过程进行干预。同时,通过生物信息学分析,我们预测PTEN可能是miR-532-5p的下游靶基因之一。因此,miR-532-5p也许可以通过PTEN/PI3K/Akt信号通路来对卒中后脑缺血性损伤产生影响。在本研究中,我们通过小鼠大脑中动脉闭塞模型对miR-532-5p对缺血性卒中的影响进行了观察,然后我们在离体实验中研究了miR-532-5p对小鼠脑神经瘤细胞系（mouse neuroblastoma cells,N2a）经历糖氧剥夺过程的影响,并对miR-532-5p对PTEN和Akt的影响进行了进一步探讨。方法:1.实验动物:雄性C57BL/6小鼠（8周龄）,适应性喂养一周后随机分为4组:假手术组（Sham）、模型组（MCAO）、模型+Negative control mimic组（MCAO+NC mimic）和模型+miR-532-5p mimic组（MCAO+miR-532-5p mimic）。2.侧脑室注射:根据小鼠脑立体定位图谱,确定穿刺位置,根据组别不同经右侧脑室内注射相应试剂。3.大脑中动脉闭塞模型:侧脑室注射24小时后,采取线栓法制备小鼠大脑中动脉闭塞模型。假手术组除不进行线栓插入外余步骤与其他各组相同。4.神经功能缺损评分:在缺血再灌注24小时后,采用18点评分系统对各组小鼠进行假手术或者缺血再灌注后神经功能损伤的评分。5.TTC染色和梗死体积的测定:过量麻醉处死小鼠,迅速取脑后将脑组织用2%TTC染液进行染色,随后拍照,计算梗死体积。6.细胞培养、转染及糖氧剥夺过程:按实验分组接种细胞:对照组（Control）、糖氧剥夺组（OGD）、糖氧剥夺+NC mimic组（OGD+NC mimic）、糖氧剥夺+miR-532-5p mimic组（OGD+miR-532-5p mimic）。培养后进行转染,转染完成经历糖氧剥夺过程。对照组不经历该过程。7.Nissl及TUNEL染色:采用Nissl染色的方法检测坏死的神经元及脑损伤情况。采取TUNEL染色的方法检测凋亡的细胞。8.总RNA提取及实时定量PCR:在提取了样本的总RNA后,测定总RNA的纯度及浓度。随后将RNA样本逆转录为cDNA然后进行实时定量PCR过程。PTENmRNA及miR-532-5p的相对表达量通过2^-ΔΔCt的方法计算得出。9.Western blot:脑缺血半暗带内PTEN、p-Akt、Akt的表达水平及N2a细胞内PTEN、p-Akt、Akt、Bax、cleaved caspase-3、cleaved PARP及Bcl-2的表达水平通过Western blot的方法进行检测。10.细胞活力测定:接种细胞至96孔板,培养后于37℃以CCK-8溶液孵育2小时,随后测定450 nm处的光密度值。11.双荧光素酶检测:构建荧光素酶报告基因质粒,将报告质粒及miR-532-5p mimic或NC mimic共转染293T细胞,随后对荧光素酶活性进行检测。12.统计分析:所测数据结果均用?±s（均数±标准差）表示,用双尾无配对学生t检验及One-way ANOVA分析结果,事后分析采用Tukey法。P值小于0.05认为有统计学意义。结果:1.小鼠大脑中动脉缺血模型脑内miR-532-5p及PTEN的表达变化RT-qPCR检测结果显示与假手术组相比,MCAO组脑缺血半暗带内miR-532-5p表达水平显著下降（p<0.001）,而PTENmRNA的表达水平明显升高（p<0.001）。2.MiR-532-5p减轻了小鼠脑卒中后的缺血性脑损伤与假手术组相比,MCAO组小鼠神经功能缺损评分明显下降,而MCAO+miR-532-5p mimic组神经功能缺损评分较MCAO组升高（p<0.001）。与MCAO组相比,MCAO+miR-532-5p mimic组的梗死体积有所减小（p<0.001）。Nissl染色结果显示,与Sham组相比,MCAO组缺血半暗带内凋亡坏死的神经元数量明显增加,而MCAO+miR-532-5p mimic组鼠脑缺血性半暗带内凋亡坏死的神经元数量较MCAO组有所减少（p<0.001）。MCAO组小鼠脑缺血半暗带内TUNEL染色阳性的细胞数明显高于Sham组,而MCAO+miR-532-5p mimic组脑组织同部位TUNEL染色阳性细胞数较MCAO组减少（p<0.001）。3.MiR-532-5p促进了小鼠大脑中动脉缺血模型脑内PI3K/Akt信号通路的激活MCAO组脑缺血半暗带内PTEN蛋白的表达水平明显高于Sham组,应用miR-532-5p mimic后,脑缺血半暗带内PTEN蛋白表达水平所有下降（p<0.001）。MCAO组的p-Akt的蛋白表达水平明显低于Sham组,应用miR-532-5p mimic后,脑缺血半暗带内p-Akt的蛋白表达水平较MCAO组上升（p<0.001）。同时RT-qPCR结果显示,MCAO+miR-532-5p mimic组脑组织内miR-532-5p表达较MCAO组明显上调（p<0.001）。同蛋白表达变化一致,MCAO后PTENmRNA的表达升高,而应用miR-532-5p mimic后,抑制了MCAO后PTENmRNA的表达变化（p<0.001）。4.MiR-532-5p减轻了经历糖氧剥夺后的小鼠脑神经瘤细胞的凋亡与对照组相比,OGD组N2a细胞内miR-532-5p表达明显下降（p<0.01）,而OGD+miR-532-5p mimic组细胞内miR-532-5p表达水平较OGD+NC mimic组和OGD组升高（p<0.001）。CCK-8检测发现OGD组N2a细胞活力明显下降,而OGD+miR-532-5p mimic组细胞活力较OGD+NC mimic组及OGD组活力增强（p<0.01）。TUNEL检测发现,OGD组凋亡细胞较对照组增多,而OGD+miR-532-5p mimic组凋亡细胞数较OGD+NC mimic组及OGD组减少（p<0.001）。Western blot结果显示,OGD组细胞内Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白表达水平升高而Bcl-2蛋白表达水平下降（p<0.001）。而转染miR-532-5p mimic则减轻了OGD后N2a细胞内Bax、cleaved caspase-3及cleaved PARP蛋白表达水平的升高,提高了Bcl-2蛋白表达水平（p<0.05）。5.MiR-532-5p促进了经历糖氧剥夺后的小鼠脑神经瘤细胞内PI3K/Akt信号通路的激活Western blot检测结果显示,OGD组细胞内PTEN蛋白表达水平明显升高,而转染miR-532-5p mimic则抑制了OGD后N2a细胞内PTEN蛋白表达水平的升高（p<0.001）。相反地,OGD组细胞内p-Akt蛋白的表达水平降低,而转染miR-532-5p mimic升高了OGD后N2a细胞内p-Akt蛋白的表达水平（p<0.001）。6.PTEN被证实为miR-532-5p的下游靶基因之一双荧光素酶检测结果显示miR-532-5p mimic抑制了包含PTEN-WT-seed1及PTEN-WT-seed2的荧光素酶报告载体的荧光活性（p<0.05）,而NC mimic却无上述作用。针对包含PTEN-MUT-seed1及PTEN-MUT-seed2的荧光素酶报告载体,miR-532-5p mimic却没有显示抑制荧光活性的作用（p>0.05）。转染了miR-532-5p mimic的N2a细胞miR-532-5p的表达明显升高,而转染了miR-532-5p inhibitor的N2a细胞miR-532-5p的表达明显下降（p<0.001）。RT-qPCR及Western blot检测均发现miR-532-5p mimic可造成N2a细胞内PTENmRNA及PTEN蛋白表达水平减低,而miR-532-5p inhibitor可使N2a细胞内PTENmRNA及PTEN蛋白表达水平升高（p<0.001）。这些结果均证实PTEN为miR-532-5p的下游靶基因之一。7.过表达PTEN减弱了miR-532-5p对经历糖氧剥夺后的小鼠脑神经瘤细胞的保护作用CCK-8及TUNEL检测均发现,在转染了miR-532-5p mimic及经历OGD过程后,过表达PTEN的N2a细胞与转染了空白质粒的N2a细胞相比,细胞活力下降更加明显（p<0.05）,细胞凋亡数量更多（p<0.001）,PTEN蛋白的表达水平更高（p<0.001）,p-Akt蛋白表达水平更低（p<0.001）。结论:1.本实验发现miR-532-5p可以减少脑卒中后的梗死体积,改善神经功能缺损,减轻梗死后的细胞凋亡。2.MiR-532-5p减轻了经历糖氧剥夺后的N2a细胞的凋亡及细胞活力下降。3.证实了PTEN为miR-532-5p的下游靶基因之一。4.我们发现miR-532-5p可能是通过与靶基因PTEN相结合,抑制了PTEN的表达,进一步激活了PI3K/Akt信号通路,对脑缺血性损伤发挥了保护作用。