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目的:探讨不同浓度水平的纤维蛋白原(Fg)及其降解产物(Fb和FDPs)在动脉粥样硬化(AS)发病中的作用及其分子机制。方法:第一部分:以Transwell膜为载体,建立原代培养的兔主动脉内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs)共培养体系,对两种细胞的生长特性和SMCs的正常表型转换规律进行观察。第二部分:应用不同浓度(0mg/ml、0.5mg/ml、1.5mg/ml、3.0mg/ml、4.5mg/ml和6.0mg/ml)Fg、Fb和FDPs对共培养体系进行干预,观察该体系中SMCs的蛋白合成(BCA法)、细胞表型转换标志物α-SM-actin(RT-PCR法)、增殖细胞核抗原(PCNA)(western blot法)以及细胞移行(刮伤模型)变化。第三、四部分:应用在不同浓度Fg、Fb和FDPs干预共培养体系后,分别从基因转录(RT-PCR法)、蛋白表达(ELISA法)和活性变化(发色底物法/明胶酶谱法/MTT法)水平检测该体系tPA、PAI-1、MMP-2、-8和VEGF的表达情况,并观察在此过程部分浓度组别中ECs和SMCs核转录因子(NF)-κB途径活化情况。第五部分:应用HE染色对人AS不稳定斑块进行了组织学观察、筛选,然后利用免疫荧光双标技术和激光共聚焦显微镜观察MMP-2、-8和VEGF在人不稳定斑块上的定位共表达情况。结果:第一部分:原代培养的兔主动脉ECsⅧ因子抗体免疫组化染色呈阳性。在共培养条件下,ECs和SMCs在Transwell膜上生长良好,ECs单层生长,呈“鹅卵石”样外观;SMCs多层生长,呈明显“峰-谷”状外观。膜两侧的ECs和SMCs可以发生细胞连接。从第3天开始SMCs表现为增殖表型的形态特征,第6天以后,出现收缩表型的形态特征。第二部分:较高浓度的Fg(≥3.0mg/ml)可明显促进SMCs的蛋白合成、PCNA表达以及趋化迁移,同时抑制SMCsα-SM-actin的转录过程;Fb从0.5mg/ml起就可明显促进SMCs的蛋白合成。1.5-4.5mg/ml的Fb可明显上调PCNA表达,浓度过高的Fb(6.0mg/ml)反而抑制其表达。3.0-6.0mg/ml的Fb显著促进SMCs趋化,下调α-SM-actin mRNA的表达,但从1.5mg/ml起Fb就可明显加强SMCs的迁移过程;在0.5-6.0mg/ml之间,FDPs呈浓度依赖性地促进SMCs蛋白合成、PCNA表达和移行,但只有较高浓度的FDPs(3.0-6.0mg/ml)可显著抑制SMCs向收缩表型转换。第三部分:Fg对tPA的表达没有显著影响,较高浓度的Fg(3.0-4.5mg/ml)可明显促进PAI-1mRNA表达、抗原含量及活性升高,但过高浓度的Fg(6.0mg/ml)却抑制PAI-1的表达;3.0-4.5mg/ml的Fb对tPA mRNA和抗原含量都起上调作用,同时显著下调tPA活性;较高浓度的Fb(1.5-4.5mg/ml)则可明显上调PAI-1的表达,且在mRNA、蛋白和活性水平趋势基本一致;3.0-6.0mg/ml的FDPs均可明显下调tPAmRNA、蛋白表达和活性水平,1.5-6.0mg/ml的FDPs均可促进PAI-1的高表达。第四部分:4.5-6.0mg/ml的Fg能明显上调MMP-2的转录、蛋白表达和降解明胶的活性;3.0-6.0mg/ml浓度的Fb显著能促进MMP-2的高表达和活性上调;在观察的FDPs浓度(0.5-6.0mg/ml)范围内,MMP-2 mRNA呈浓度依赖性高表达;但只在中高浓度(1.5-6.0mg/ml)FDPs亚组上清中检测到MMP-2抗原含量显著升高和活性上调。而中浓度(1.5mg/ml)以上的Fg及其降解产物Fb和FDPs均可促进VEGF的高表达,这在mRNA、蛋白和活性水平趋势基本一致。3.0-6.0mg/ml的Fg、1.5-6.0mg/ml的Fb和FDPs均可呈浓度依赖性地显著上调细胞上清中MMP-8水平,但在过高浓度(6.0mg/ml)的亚组都略有下降,但仍明显高于空白对照组。在中高浓度(3.0-6.0mg/ml)的Fb和FDPs干预下,ECs和SMCs均见到NF-κB激活,NF-κB特异拮抗剂SN50能抑制ECs和SMCs MMP-2和VEGF的表达,对MMP-8的表达却没有影响。第五部分:所有病例均有AS斑块的组织学特征,且均为Ⅳ型以上的不稳定性斑块;MMP-2在单核细胞浸润的斑块纤维帽平滑肌细胞和肩部单核细胞中表达最为显著,在肩部和脂质坏死区边缘增生微血管内皮细胞中也有较多表达;MMP-8表达最多见于纤维帽和脂质核心内的单核细胞中,其次共表达在纤维帽的平滑肌细胞中,内皮细胞中表达很弱很少;VEGF在肩部增生的微血管内皮细胞中表达最为明显,由平滑肌细胞构成的纤维帽和有较多单核细胞浸润的脂质坏死区边缘也是VEGF的高表达区域。结论:第一部分:成功建立了兔主动脉ECs-SMCs共培养体系,该体系能较好地模拟血管壁的结构关系,有很好的生物相容性,不影响细胞的生物活性和生长特性。第二、三部分:一定浓度的Fg、Fb及FDPs可以促进SMCs增殖和异常表型转换、影响其趋化迁移过程,同时可调控血管ECs tPA和PAI-1的表达,降低血液纤溶活性,从而参与了AS的发生发展。第四部分:Fg、Fb及FDPs通过影响血管ECs-SMCs MMP-2、-8和VEGF的表达参与了AS斑块不稳定进程,其中Fb及FDPs的这一效应可能是通过NF-кB途径介导的。第五部分:MMP-2、-8和VEGF可以与人不稳定斑块中的单核细胞、SMCs和ECs明显共表达,表达区域主要集中在单核细胞浸润明显的斑块纤维帽、肩部以及脂质坏死区边缘新生微血管周围,血管外膜也参与了AS的发病过程。从在体水平证实了Fg、Fb及FDPs可以通过影响MMP-2、-8和VEGF的表达参与了AS斑块不稳定进程。