前言众多研究表明：在急性胰腺炎（Acute Pancreatitis，AP）发生、发展中产生了大量活性氧及自由基（Reactive Oxygen Species，ROS），同时伴有内源性抗氧化剂消耗从而引起了氧化应激损伤。在AP早期有两个具有特征性的病理、生理事件：其一为actin细胞骨架变化；其二为细胞间隙迅速扩大，此时富含蛋白的细胞外液流入，这反映了胰腺水肿的共有现象。腺泡细胞中F-actin排列紊乱，肌动蛋白细胞骨架的基本组成蛋白改变是细胞骨架变化进而干扰酶原分泌及细胞功能的原因。含微丝的actin负责细胞的张力性延伸并参与细胞黏附分子复合体的形成。胰腺细胞这一细胞间粘连对于维持腺细胞极性及细胞间隙、防止酶原颗粒进入胰腺间质具有重要意义。黏附分子复合体主要分子是钙依赖性细胞黏附蛋白或钙粘素，对于上皮细胞最主要的是E-cadherin。在AP时E-连接复合体解聚、E-cadherin重新分布于胞浆并引起了细胞间连接破坏、细胞间隙扩大。小热休克蛋白27（HSP27）是actin聚合的磷酸化依赖性调控子，HSP27极有可能参与了AP过程中细胞骨架的调控，而HSP27及其他HSPs可由细胞应激诱导，其数量及磷酸化程度可能对AP的结局有影响。HSP27磷酸化是由独特信号传导通路调节的包括：P38 MAPK及MAPK活化激酶2／3。actin调控及谷胱甘肽保护均源于HSP27的保护作用。HSP27磷酸化可以消除阻碍F-actin积聚的作用并引起细胞骨架变化。故而推测HSP27及其他HSPs如HSP70等蛋白表达及磷酸化升高可对细胞结构完整性起到保护作用。氨基葡聚糖（Glycosaminoglycans，GAGs）是一个大的异质多糖家族，是置涣性硫酸多聚体（除透明质酸，HYA），由转化的己糖醛酸组成（除硫酸角质素，KS）。己糖胺单位，在所有活体器官中有重要作用，它们的结构和异质程度具高度特异性。一些蛋白具有与GAGs的结合能力，可能反应出功能性关联或许也揭示了它们以多种不同方式而进行的不同的生理功用。GAGs存在于血中，正常人血中主要的GAGs是软骨素-4-硫酸（C4S），为低硫酸形式。近期有诸多文献报道了GAGs，特别是C4S在各种体内／外实验性模型中具有抗氧化作用。生物化学、细胞学、生物学的发展揭示出GAGs不仅只是细胞外基质的组成，而且调控一些细胞事件和生理过程。从生理学角度解释了在AP及其他疾病中GAGs增加的原因。事实上，GAGs升高可能是对抗自由基产生的生物反应。硫酸软骨素可缓解抗氧化剂消耗及胰腺损伤，但GAGs对AP时胰腺细胞骨架、细胞连接等与AP关系密切的细胞变化的影响，尚未见研究报道。本研究分三部分论文一硫酸软骨素腹腔注射预处理对大鼠急性坏死性胰腺炎胰腺细胞的保护作用方法雄性Wistar大鼠（n=90）。随机分为3组：A组，急性坏死性胰腺炎组；B组，硫酸软骨素处理组；C组，假手术组，仅翻动胰腺。动物模型采用Aho等的方法。腹腔注射10％水合氯醛麻醉动物后剖腹，在手术显微镜下进行牛磺胆酸钠胆胰管逆行注射。B组动物在ANP诱导前1h，腹腔注射硫酸软骨素（30mg／kg），A、C组以等量盐水代替。各组动物分别在30′、1、3、6、12h处死，取腹主动脉血测定SAM。切取12指肠窗内胰腺组织测定MDA、GSH、SOD和ATP含量。在胰尾部组织中迅速切取1mm³小块固定于2％戊二醛固定液中送电镜检查。其余部分以中性甲醛固定做HE染色进行病理评分。以TAB比色法测定MDA；以亚硝酸盐形成法测定SOD；以Beutler改良法测定GSH；用色谱法测定ATP含量。观察胰腺组织的病理学变化（包括大体组织形态、光镜及电镜下的病理变化）。结果A、B两组均有SAM水平的升高，病理组织学上有相应的ANP变化。同一时点比较发现：A组胰腺组织中GSH、SOD、ATP明显下降（P＜0.05）、MDA明显升高（P＜0.05）；B组则GSH、SOD、ATP下降幅度较小，与A组比较差异有显著性（P＜0.05），MDA升高幅度小，与A组比较差异有显著性（P＜0.05）。结论ANP时胰腺组织中内源性抗氧化物质显著下降，脂质过氧化增加。有明显的氧化应激损伤，硫酸软骨素腹腔注射预处理可作为氧自由基清除剂明显减轻ANP大鼠胰腺细胞损伤。论文二硫酸软骨素腹腔注射对ANP大鼠胰腺细胞间连接和F-actin细胞骨架的稳定作用方法雄性Wistar大鼠（n=90），随机分三组：A组为急性坏死性胰腺炎模型组（ANP）（5％牛磺胆酸钠逆行胰管注射）；B组为硫酸软骨素处理组；C组为假手术组。三组动物分别于30′、1h、3h、6h、12h处死。检测胰腺系数（胰湿重／鼠体重×100％）；透射电镜观察细胞间连接的变化；在激光共聚焦显微镜下观察粘合连接蛋白—E-钙粘素（E-cadherin）在细胞内分布、定位的变化；western-blot进行E-cadherin蛋白半定量检测及RT-PCR显示其mRNA的变化趋势。以罗丹明—法罗丁进行F-actin染色，在共聚焦激光显微镜下观察并采集图象、荧光值分析。胰腺的HSP27组化染色，应用HSP27和HSP27磷酸化抗体进行western-blotting半定量分析HSP27蛋白及其磷酸化蛋白的含量。应用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表达。结果A组胰腺系数迅速升高并持续增长，间质水肿严重（P＜0.05），细胞间连接损伤，E-cadherin弥漫分布于胞浆内，western-blot及RT-PCR结果显示E-cadherin蛋白含量持续下降（P＜0.05）而其mRNA水平明显升高（P＜0.05）；在B组中发现间质水肿比A组差（P＜0.05），细胞连接稳定，虽E-cadherin在细胞内分布、定位紊乱，但其蛋白水平明显高于A组（P＜0.05），而mRNA水平与A组无明显差异（P＞0.05）。实验性急性胰腺炎早期就存在细胞骨架的急剧变化和F-actin含量降低。硫酸软骨素引起了HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表达水平升高，缓解了actin细胞骨架的损伤。结论在牛磺胆酸钠诱导的实验性ANP早期，存在细胞粘合蛋白—E-cadherin的降解，胰腺细胞连接解体从而引起胰腺水肿，以及细胞骨架的剧烈变化，F-actin分布紊乱、含量降低。同时伴随有HSP27蛋白、HSP27磷酸化蛋白、mRNA表达升高。HSP27在结构较好的腺泡细胞中高表达说明，HSP27可能具有保护作用。硫酸软骨素（CS）作为氨基葡聚糖家族（GAGs）主要成员之一，通过缓解稳定了细胞连接从而减轻了胰腺水肿。同时，硫酸软骨素增高了HSP27的应激表达缓解了细胞骨架损伤。硫酸软骨素引起的HSP27表达升高可能源于它的细胞保护作用从而减少了蛋白损伤。另外，基因表达增高也可能参与了这一作用。论文三硫酸软骨素增加HSP27蛋白及其磷酸化表达减轻离体胰腺细胞骨架损伤的机制方法细胞提纯时采用了一种改良的方法，取健康的雄性Wistar大鼠10只，体重200-250克，以乙醚吸入方法麻醉动物后浸于75％乙醇中消毒。无菌条件下，于超净工作台上，在手术显微镜下，经胆胰管汇合处穿刺缓慢逆行注入细胞分离液（2mg／mL浓度的Ⅰ型胶原酶，3-5mL），然后迅速切取胰腺，将胰腺组织剪碎为约1-3mm³小块后，加入预热的细胞分离液，在37℃水浴箱中搅动120rpm消化10分钟。经过过滤、离心，提取胰腺腺泡细胞的单细胞悬液并收集细胞放于CO₂孵箱内（37℃，5％CO₂）。细胞计数：吸取少量细胞悬液，加到细胞计数板上，在倒置显微镜下（10×物镜）计数细胞数目。细胞活性测定（台盼蓝排斥实验）：计数活细胞和死细胞数目，计算细胞活性率。腺泡细胞纯化率鉴定：将细胞悬液调整到10⁵-10⁶个／mL浓度后，在离心涂片仪上进行细胞离心涂片（1000rpm，10分钟）制成细胞切片，分别给予HE染色和酶原颗粒的亚甲蓝特殊染色，计算出腺泡细胞纯化率。细胞分离后随机分为三组：ANP组（A组）；ANP+硫酸软骨素组（B组）；对照组（C组）。在B组中细胞悬液与4％的硫酸软骨素预孵30分钟后，以0.2％牛磺胆酸钠分别处理30分钟、1小时、3小时。但A组和C组仅给予等量生理盐水预孵，并且在C组中仅给予等量生理盐水代替牛磺胆酸钠进行细胞处理。以罗丹明—法罗丁进行F-actin染色，在共聚焦激光显微镜下观察并采集图象，以流式细胞仪进行细胞F-actin含量测定。应用HSP27和HSP27磷酸化蛋白（Ser15、86）抗体进行western-blotting半定量分析HSP27和HSP27磷酸化蛋白含量。应用RT-PCR方法半定量分析HSP27 mRNA表达。结果在倒置显微镜下计数细胞数目，按公式计算：细胞数目=（4大格细胞数之和／4）×10⁴×细胞原液量（mL）得出平均每只大鼠可提取细胞数目为4.7±0.6×10⁶个细胞与文献报道无统计学差异。细胞活性率：台盼蓝排斥实验，蓝染者为死细胞，计算活细胞率为91±7％，符合文献报道。腺泡细胞纯化率：分别计数10个高倍视野的HE切片上的细胞数和亚甲蓝特殊染色切片上的细胞数，计算出腺泡细胞纯化率。不同文献报道的腺泡细胞纯化率从40-60％到80-90％差异较大，本实验中得到的腺泡细胞纯化率为70-80％。牛磺胆酸钠处理离体胰腺细胞后，早期就存在细胞骨架的急剧变化和F-actin含量降低。硫酸软骨素缓解了actin细胞骨架的损伤，引起了HSP27、HSP27磷酸化蛋白及其mRNA表达水平升高。结论本实验中的改良方法具有耗酶量少、技术难度小的特点，是一种简易、经济的大鼠胰腺腺泡细胞分离、纯化的方法。可以直接制备单细胞悬液，更加便于施加处理因素，并有利于进行western-blotting，RT-PCR等电泳实验。非常适合于急性胰腺炎早期（12小时内）胰腺腺泡细胞病理、生理变化的研究。牛磺胆酸钠诱导的离体胰腺细胞损伤早期就有细胞骨架的剧烈变化，F-actin分布紊乱、含量降低。同时伴随有HSP27、HSP27磷酸化蛋白和mRNA表达升高。硫酸软骨素进一步增高了HSP27及其mRNA的表达水平缓解了细胞骨架损伤。