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本研究利用含硒平板培养基初筛、含硒液体培养基复筛的方式,筛选得到1株耐硒菌株SR14,经鉴定该菌株为益生菌副地衣芽孢杆菌,并对其还原亚硒酸钠的能力、发酵产物各组分含量和微观形态结构进行了初步分析。同时,本研究初步探究了益生菌SR14（BP）和富硒发酵产物（S-BP）对四种自由基的体外清除能力。在此基础上,通过构建H2O2诱导的猪肠道上皮细胞氧化应激模型,研究并比对了 BP和S-BP缓解细胞氧化应激的作用,并利用荧光分析、流式细胞术、凋亡检测、Western Blot等一系列实验探究了 S-BP和BP发挥抗氧化功能的可能分子机制。主要研究结果如下:1.富硒益生菌的筛选本研究采用含硒平板培养基初筛的方法,从60株菌株中筛选得到可耐受5 mmol/L亚硒酸钠的菌株10株,分别为第1、2、5、14、15、16、24、32、41、57号菌株。进一步利用含梯度浓度无机硒的液体培养基,对10株菌株进行复筛。结果表明,10株菌株均能在含5mmol/L亚硒酸钠的液体筛选培养基中正常生长。但部分菌株如16、32、41号,发酵后培养基红色较浅,提示菌株转化亚硒酸钠能力弱于其他菌株;其中14号菌株在液体筛选培养基中硒含量达到100 mmol/L时,仍能正常生长。14号菌株培养基于接种后26小时呈明显的红色,且发酵结束时培养基红色较深。根据培养基变红的快慢以及发酵结束后的颜色,提示14号菌株具有最佳耐硒能力,命名为SR14。2.富硒益生菌鉴定及性状表征本研究根据SR14菌株的细胞形态和生理生化特征,并利用16S rDNA和gyrB基因测序,鉴定其为Bacillus paralicheniformis副地衣芽孢杆菌。在此基础上,通过不同浓度亚硒酸钠的完全培养基进行发酵,确定了富硒益生菌SR14发酵48小时后可完全还原2 mmol/L亚硒酸钠。通过多批次重复发酵,测得每升SR14富硒发酵液干燥后可得干物质38.2±0.5g;发酵产物中亚硒酸钠未检出;含总硒4026.1±120.9mg/kg,单质硒1296.3±130.1 mg/kg,单质硒约占总硒的30%,剩余部分为有机硒,从而获得了较为稳定的产品参数。此外,利用场扫描电镜（FESEM）、透射电镜（TEM）、傅里叶红外交换光谱（FTIR）能谱分析等方法,探究了富硒益生菌SR14发酵产物的微观性状,结果显示菌体未受亚硒酸钠影响,呈正常的长杆状。产物在2926cm-1处有C-H的伸缩振动吸收峰,在1644和1408cm-1处有C=O和COO-的伸缩振动吸收峰,在860 cm-1和764 cm-1处有α-异构体吡喃糖的伸缩振动吸收峰,表明富硒益生菌分泌了糖类化合物,将转化后的硒包裹成球状,运输至胞外。3.富硒芽孢杆菌抗氧化功能探究本实验首先采用体外化学实验研究了益生菌SR14（BP）及其富硒发酵产物（S-BP）在体外对四种自由基的清除作用。结果表明,BP具有清除超氧阴离子和DPPH自由基的能力,且对羟自由基的清除率接近100%,但没有ABTS自由基的清除能力。而S-BP具有更强的清除自由基能力,对超氧阴离子、DPPH、ABTS自由基的清除能力都优于BP本身。同时,通过建立H2O2诱导的猪肠道上皮细胞IPEC-J2氧化应激模型,研究了 S-BP和BP对细胞氧化应激的保护作用。结果表明,单独使用BP或S-BP处理对IPEC-J2细胞生长无影响。当使用400μmol/LH2O2处理IPEC-J2细胞10小时,会导致其生长下降至正常情况的60-80%;而当预先在IPEC-J2细胞中加入10和20 μmol/L的S-BP或加入5× 104 CFU/mL的BP处理4小时之后,能够显著缓解H2O2诱导的细胞生长抑制。此外,当预先在IPEC-J2细胞中加入10和20 μmol/L的S-BP或加入5×104和1×105 CFU/mL的BP处理4小时之后,能够显著降低H2O2诱导的细胞LDH释放。以上结果提示S-BP和BP对IPEC-J2细胞氧化应激拥有较强的保护作用,且富硒发酵后益生菌抗氧化能力得到了增强。4.富硒芽孢杆菌缓解H2O2诱导的猪肠上皮细胞氧化应激的机制探究本实验在初步探究了 S-BP和BP抗氧化功能的基础上,进一步探究了 S-BP和BP缓解IPEC-J2细胞氧化应激的机制,并探究了二者抗氧化能力存在差异的潜在原因。结果表明,BP和S-BP预处理均能缓解氧化应激细胞MDA生成和ROS释放增加。同时,通过荧光观察和流式细胞术分析细胞凋亡情况,结果显示,与对照组相比,H2O2组凋亡细胞占比显著升高,而10和20 μmol/L的S-BP预处理显著降低了凋亡细胞所占百分比,结果与对照组接近。1×105 CFU/mL的BP预处理降低了凋亡细胞占比,但效果弱于S-BP。进一步通过Western Blot和通路蛋白抑制剂,辩证地探究了 S-BP和BP对氧化应激细胞MAPK相关通路蛋白表达的影响。结果显示,相比于H2O2处理组,S-BP处理显著提高了 ERK和p38 MAPK蛋白的磷酸化水平,而BP对ERK、p38和JNK蛋白的磷酸化水平和总蛋白水平均无显著影响,提示S-BP激活了 ERK/p38 MAPK信号通路从而缓解H2O2诱导的氧化应激,这可能也是S-BP抗氧化功能优于BP的潜在原因。综上所述,本实验从60株待筛菌株中筛选得到1株最佳耐硒菌株SR14,经鉴定其为Bacillus paralicheniformis副地衣芽孢杆菌。进一步系统评估了 SR14发酵产物各组分含量,表征发酵产物及分离后的单质硒的各项性状。随后将富硒发酵产物与不含硒发酵产物利用体外自由基实验及猪肠道上皮细胞氧化应激模型,探究二者的抗氧化功能及潜在机制。