兽医学研究表明哺乳动物的红细胞具有免疫粘附功能。然而,目前仅对灵长类动物的红细胞CR1的研究较为清楚,关于其他非灵长类动物红细胞的免疫粘附受体的蛋白质特性、红细胞膜上的分布状态、编码基因结构及其染色体定位、免疫功能机制等方面的研究缺乏数据。课题组前期研究分离鉴定了猪红细胞免疫粘附分子CR1-like,但是猪红细胞免疫相关分子机制还有一系列基础性问题需要进一步探讨。例如:影响CR1-like免疫活性的生理性因素有哪些?分布于红细胞表面的锚合特点如何?CR1-like序列在物种水平是否具有同源保守性?猪红细胞CR1-like是否具有分子多态性?鉴于上述背景及依据,本研究以猪红细胞CR1-like为研究靶点,制备猪CR1-like多克隆抗体,深入分析猪红细胞CR1-like连接膜骨架蛋白的脚手架区域类别,解析CR1-like与猪红细胞膜相互作用的分子基础;从ATP与猪红细胞CR1-like相关性为研究靶向,利用流式细胞检测技术、荧光免疫细胞化学技术、免疫阻断技术等探讨ATP调节CR1-like免疫粘附功能的作用;为进一步阐明CR1-like介导猪红细胞发挥免疫功能的分子机制提供理论数据;应用基因文库构建技术、SNP筛查技术等研究方法初步建立猪红细胞CR1-like免疫粘附功能的遗传学基础,以期为进一步开发猪红细胞CR1-like基因多态性应用于临床生产奠定理论基础,提供科学数据。研究结果如下:1、应用家兔血清免疫法获得具有免疫学活性的猪CR1-like膜结合肽段的抗血清,为猪红细胞CR1-like分布研究提供了研究工具;利用真核表达技术获得了能够稳定遗传表达猪红细胞CR1-like活性片段重组CCP片段的重组毕赤酵母菌株,表达出重组蛋白CCP,表达量0.945mg/mL;体外活性研究发现重组蛋白CCP具有补体结合活性及类免疫粘附功能。2、免疫荧光细胞化学染色结果可以看出CR1-like与猪红细胞膜骨架中的FAP-1分子两者的特异性荧光位点分布相同;对253个典型的阳性红细胞进行位点距离的差平方求和,结果为0.2224,表明每组CR1-like、FAP-1的位点距离之差近似为0,即CR1-like、FAP-1分布符合共位关系的特征;通过免疫共沉淀技术检测,被检测的凝胶中清楚地观测到FAP-1分子。3、CR1-like与稀释度为1:1600的CR1-McAb作用时ATP消耗也因此明显低于其它稀释度组。CR1-like在与抗体结合时消耗了猪红细胞内的ATP,而且根据不同稀释度因素下的ATP浓度水平的差异也可以初步推断出CR1-like免疫活性越强,ATP消耗越多,两者之间存在显著相关性。当ATP介入浓度由10-14mol/mL、10-13mol/mL、10-12 mol/mL、10-10mol/mL、10-8 mol/mL依次升高时,CR1-like膜表达水平在各组中无统计差异;当 ATP 介入浓度由 10-14mol/mL、10-13 mol/mL、10-12mol/mL、10-10 mol/mL、10-8mol/mL依次升高时,CR1-like免疫粘附荧光颗粒数量也随之增高,粘附细菌的效率也随之增强,当ATP介入浓度为10-10mol/mL时,CR1-like粘附颗粒数量达最高,此后继续提高ATP介入浓度至10-8mol/mL时,CR1-like粘附颗粒数量不再变化。4、在上述研究结果的基础上,本实验进一步构建CR1-like基因文库并对其候选SNP进行了筛查。本研究构建了 41例长白猪CR1-like基因文库,文库序列覆盖率均在95%以上,98%的文库序列reads覆盖率达97%以上;通过与参考基因组比较,实验在CR1-like基因组水平共筛出159个SNP位点。此外,根据本实验结果参考基因中74513501、74515069两位置的碱基类型应为A、T。综上所述,本文得出以下结论:1、猪红细胞CR1-like并不是直接与红细胞膜骨架蛋白进行结合,而是通过FAP-1蛋白分子铆合结构分布于猪红细胞膜表面。2、CR1-like在与抗体结合时消耗了猪红细胞内的ATP,两者之间存在显著相关性;猪红细胞表面CR1-like的表达水平是天然恒定的,不因ATP浓度变化而改变;在一定浓度范围内ATP相对CR1-like免疫粘附活性具有剂量调节活性,当粘附体系中ATP剂量越大,CR1-like免疫活性越强。3、构建了 41例长白猪CR1-like基因文库,筛查获得159个候选SNP位点