抗菌肽(Antimicrobial peptides AMPs)是一类广泛存在于自然界中的小分子多肽,具有分子量小,带正电荷,两亲性等特点。目前已经有超过1600多种抗菌肽被报道,根据其结构特点可以将抗菌肽分为四类：α螺旋结构类,β折叠结构类,伸展结构类和环链结构类。作为生物天然免疫的一个重要组成部分,抗菌肽具有一系列吸引人的生物学活性,包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、抗肿瘤以及抗原虫活性,最新的研究显示哺乳动物的抗菌肽还具有炎症反应调节因子的作用,成为连接机体天然免疫和适应性免疫的一道桥梁。各种疾病持续威胁人类健康,传统的抗细菌、抗病毒和抗肿瘤药物的研发和临床使用效果却不尽如人意,尤其是抗生素滥用导致耐药菌不断出现,使得新型抗生素药物的研发显得尤为重要。抗菌肽能破坏细菌细胞膜,有些能够穿过细胞膜作用于胞内靶位点,因此抗菌肽具有抗菌谱广、作用迅速、不易诱导产生耐药性等特点。抗菌肽作为新的抗生素药物的潜力是目前研究的热点。随着对抗菌肽生物活性研究的深入,缺乏低成本、大量制备抗菌肽的有效方法,逐渐成为抗菌肽研究甚至将来其作为蛋白质药物发展的一个瓶颈。传统的从天然资源中提取的方法繁琐低效,蛋白质量难以保证；化学合成的方法成本高昂,蛋白的天然活性难以保证。利用基因工程技术大量表达纯化抗菌肽是目前较可行的途径,但是也存在着许多不足：常见的酵母表达系统产量低、周期长、规模化生产投资大；大肠杆菌等原核表达系统为了避免抗菌肽对宿主细胞的毒性,只能采取表达融合蛋白的方法,先分离纯化融合蛋白,酶切融合蛋白后再次分离纯化得到目的抗菌肽,费时费力,成本较高。研究通过细菌刺激小菜蛾的幼虫,提取总RNA后反转录PCR方法得到小菜蛾抗菌肽pxCECA1,通过对pxCECA1的序列分析,发现pxCECA1包含一个由22个氨基酸组成的信号肽以及成熟肽N端的两个氨基酸。结构分析显示pxCECA1成熟肽为两亲性,带5个单位的正电荷,整个分子为α-螺旋结构。序列比对显示,pxCECA1与小菜蛾已报道其它的两种cecropin仅仅只有几个氨基酸的差异,而且与其它鳞翅目昆虫的cecropin家族抗菌肽也有着非常高的同源性。为了解决在大肠杆菌系统中高效制备抗菌肽的问题,我们采用了pET系统和IMPACT-TWIN系统,将pxCECAl分别插入表达载体pET-32a(+)和pTWIN1,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达。在pET表达系统中,pxCECA1以融合蛋白的形式表达后,通过镍柱分离纯化,得到的融合蛋白经过肠激酶轻链酶切,再经过超滤分离纯化,得到了目的蛋白pxCECA1。而在IMPACT-TWIN系统中,融合蛋白CBD-intein-pxCECAl经过几丁质柱分离纯化后,通过研究不同pH及温度对融合蛋白自切效率以及目的蛋白产量的影响,确定了目的蛋白产量最高的自切条件为pH6.0,4℃,48小时。通过两个表达系统的对比发现,利用IMPACT-TWIN系统制备pxCECA1工艺简单,成本较低,产量较高,每1L大肠杆菌发酵物最多能制备12.3mg目的蛋白。通过以上方法制备的pxCECA1表现出了较好的抗菌活性,对大肠杆菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌都有抑制作用,其中对大肠杆菌的MIC值最低,为4.1μg/ml,对金黄色葡萄球菌的MIC值为8.2μg/ml,要低于之前报道过的部分cecropin家族成员,尤其值得关注的是,pxCECA1对甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌MRSA表现出了与非耐药菌相同的抗菌活性。生长抑制实验和杀菌实验表明,pxCECA1对细菌的抗菌能力与其浓度呈依赖关系,且pxCECA1能够直接杀死细菌,而不仅仅是抑制细菌生长。过氧化氢酶释放实验进一步表明,pxCECA1能够通过破坏细菌细胞膜的方式杀死细菌。接下来的实验表明,pxCECA1没有溶血性,MTT法证实了pxCECA1在128Mg/ml的浓度下对MDCK细胞和Vero细胞也没有细胞毒性。将pxCECA1与A型流感病毒H3N2孵育后,病毒感染MDCK细胞,通过MTT法和空斑计数方法发现,pxCECA1没有抑制流感病毒,说明pxCECA1没有抑制流感病毒的吸附与侵入,凝血抑制实验也表明,pxCECA1并不抑制流感病毒血凝素活性。而将pxCECA1加入到流感病毒感染后的MDCK细胞中,通过MTT法和空斑计数发现,pxCECAl能够给MDCK细胞提供保护并降低了释放出的病毒的相对数量,而且这种保护作用与pxCECA1浓度呈依赖关系。为了探究pxCECA1抑制流感病毒可能的靶位点,检测pxCECA1处理后的流感病毒神经氨酸酶活性,结果发现pxCECA1并没有抑制流感病毒神经氨酸酶活性,说明pxCECA1不是通过阻碍流感病毒的出芽过程来发挥抑制作用。本研究首次利用IMPACT-TWIN系统简单而高效地制备了pxCECA1,这为今后其它抗菌肽的大量制备提供了有益的借鉴。进一步的活性分析显示,pxCECA1具有较好的广谱抗菌的活性,并且能够在体外抑制A型流感病毒H3N2,研究还对其抗菌、抗病毒机制进行了有意义的探索,为今后抗菌肽在医疗领域的应用提供了部分有价值的参考依据。