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戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是感染人类后引起肝脏疾病的一种人畜共患性病毒,在自然界中具有广泛的宿主来源。猪被认为是HEV的重要贮存宿主,主要包括基因3和4型,与人HEV的同源性可达80%-90%。猪HEV可以通过食源性或水源性途径传播给人类,因此阻断猪HEV传播具有重要的公共卫生意义。HEV ORF2编码病毒衣壳蛋白,不仅保证病毒基因组的完整性,还参与病毒多项重要生理活动;HEV ORF2上具有主要的抗原表位区,是关键的疫苗研发靶区。实验室前期原核表达的猪HEV ORF2截短蛋白（sORF2-C,aa 393-660）,经验证具有良好的抗原性和免疫原性。将其免疫小鼠后经杂交瘤制备获得抗猪HEV的三株单抗2C7,1E4和2G9。本研究通过原核表达sORF2-C截短蛋白、合成短肽等方法验证三株单抗在ORF2的结合位点,利用模拟病毒的sp239蛋白吸附HepG 2细胞,以及作为HEV感染动物模型的兔子设计试验,验证单抗在体外和体内的抗病毒中和作用,以及单抗识别表位的免疫保护作用。本研究主要内容和结果如下:1.抗猪HEV衣壳蛋白单抗识别抗原表位的鉴定原核表达sORF2-C截短蛋白后,用Western blotting与间接ELISA方法与单抗反应,找到其结合区域（4-7个氨基酸）,进一步合成短肽确定位于基因4型HEV衣壳蛋白上三株单抗2C7、2G9和1E4识别的表位分别为407EPTV410,458PSRPF462和625DFCP628。1B5是经实验室前期验证在猪、人、禽HEV上识别共有表位410VLYTS411的单抗。空间结构预测验证了2C7、2G9和1B5识别的表位部分位于病毒表面,预示其可能具有抗病毒中和活性。同时,病毒捕获试验结果显示单抗2G9,1B5和2C7分别在400,400和200 ng/孔的包被浓度下可以捕获到天然病毒;而1E4和小鼠阴性IgG均未捕获到病毒。此外,序列分析比对发现2C7、2G9和1B5识别的三个表位在人、猪、兔及等其他动物源HEV中高度保守。2.抗猪HEV衣壳蛋白单抗抗病毒中和活性的鉴定有研究显示原核表达基因1型HEV p239（368-606）蛋白可模拟病毒吸附HepG 2细胞。因此,本研究通过原核表达基因4型猪HEV ORF2对应区域的截短蛋白,命名为sp239（aa 368-606）,证明其在PB7.5溶液中组装形成多聚体。经IFA、Western blotting、FCM和RT-PCR验证,sp239可模拟病毒吸附并进入HepG 2细胞,此外,2G9、2C7和1B5均可在体外部分阻断sp239或病毒（利用低效病毒感染细胞系HepG 2）吸附HepG 2细胞;同时,本试验利用兔子作为HEV感染动物模型,将2G9、2C7和1B5（1E4与阳性血清作为阴、阳型对照组,同时设置正常组和仅攻毒组）与猪HEV粪便悬液孵育混合后接种兔子,检测其粪便排毒、病毒血症和抗体水平,发现单抗或阳性血清均能部分阻断病毒感染兔子,或相较于攻毒组,出现粪便排毒延迟现象。以上结果说明,2G9、2C7和1B5具有中和猪HEV的活性,其识别的抗原表位可作为潜在的疫苗设计靶点。3.基因4型猪HEV中和表位免疫保护效果研究基因4型猪HEV ORF2衣壳蛋白的三株单抗2G9、2C7和1B5经体内验证具有中和病毒活性,提示其识别的表位可能产生抗HEV中和抗体。因此,本试验根据三株中和表位设计合成短肽:Pep EPTV（2G9）、Pep VKLYTS（1B5）、Pep PSRPF（2C7）、Pep EPTVKLYTS（2G9-1B5）和Pep EPTVKLYTSPSRPF（2G9-1B5-2C7）;将以上短肽分别连接KLH及BSA用于免疫和检测。合成后将短肽皮下免疫兔子,待抗体水平达到峰值并稳定后耳缘静脉攻毒猪HEV,攻毒后每周检测粪便排毒、病毒血症和抗体水平等指标发现:免疫短肽Pep EPTVKLYTSPSRPF或sp239后,兔子未出现HEV所引起的致病性反应,说明上述短肽对兔子感染基因4型猪HEV具有良好的保护效果;此外,免疫短肽Pep VKLYTS,Pep PSRPF,Pep EPTV和串联表位短肽Pep EPTVKLYTS对兔子产生部分保护作用。综上所述,本研究中抗基因4型猪HEV的三株单抗2G9,1B5和2C7经体内、外试验均验证其具有抗病毒中和活性;鉴定其识别HEV ORF2上的表位分别为407EPTV410,410VKLYTS411和458PSRPF462,据此合成短肽并设计动物试验验证其可在兔子体内产生保护性抗体,保护兔子免受基因4型猪HEV的感染。因此,以上试验结果为HEV疫苗设计提供靶点和理论依据,对于HEV的防控有积极意义。