论文部分内容阅读
Wnt信号转导通路在器官的发生、癌症以及多细胞生物体轴分化过程中起着重要作用。本论文主要以红鲫中的Gsk3β和Dvl2基因为研究对象。先采用RACE(rapid-amplification of c DNA ends)克隆技术获得红鲫Gsk3β和Dvl2基因的c DNA全长,再分别通过半定量RT-PCR技术和蛋白免疫印记(Western Blot)技术分析Gsk3β和Dvl2基因在m RNA水平和蛋白水平上的表达差异。最后通过一定浓度的镉处理,比较分析了Gsk3β与β-catenin的表达情况。结果显示:(1)Gsk3β基因全长为2195bp,编码421个氨基酸,预测蛋白分子量约为46846.40,等电点为9.05。比较不同物种氨基酸的同源相似性,Gsk3β蛋白序列和斑马鱼的相似度是98.5%,与小鼠的相似度是94.2%,与非洲爪蟾的相似度是92.1%,与人的相似度是94.7%。可以看出相似度比值都较高,表明在进化过程中红鲫Gsk3β基因中拥有较高的保守性。(2)结果表明Dvl2基因全长为3042bp,编码754个氨基酸,预测蛋白分子量约为82360.64,等电点为5.89。Dvl2基因蛋白序列和斑马鱼的相似度是95.3%,与鲤鱼的相似度是97.2%,与小鼠的相似度是68.8%,与非洲爪蟾的相似度是70.5%,与人的相似度是67.3%。揭示了红鲫Dvl2基因在进化中保守性不高。(3)经过半定量RT-PCR的分析发现Dvl2基因在红鲫8个组织中表达最高的是精巢,表达量排列第二的是眼睛,其中大脑、肌肉、皮肤和卵巢4种组织表达相对持平且较高,肝脏和肾脏中的表达相对较低。Gsk3β基因在红鲫8个组织中表达最高的是眼睛,其次分别是大脑和肌肉,其余四个组织中,精巢组织和卵巢组织相对持平且较高,表达量相对较低的依次为肝脏、肾脏、皮肤组织。在红鲫不同胚胎时期的m RNA表达水平层面,Dvl2基因表达最强时期为体节期,按表达强度排列依次为肌效期、出膜期、神经胚期、囊胚期,Dvl2基因在这些组织表达相对较高,眼色素时期、体色素时期达较低,两细胞时期基本没有表达。Gsk3β基因表达最强在出膜期,按表达强度依次排列为肌效期、囊胚时期、神经胚期、体节期、眼色素、体色素、两细胞期。其中表达最低的为两细胞期,眼色素期和体色素期表达液相对较低。(4)提取红鲫8个胚胎发育时期和8种不同组织蛋白,通过Western Blot技术分析得出:Dvl2和Gsk3β蛋白在红鲫组织中特异性表达,并且表现出一定的组织差异性。Dvl2和Gsk3β在红鲫肾脏中表达最低,其次在肝脏中。Gsk3β蛋白在大脑中表达最高,其次是肌肉,在肾脏、肝脏和精巢中基本没有表达。而Dvl2在精巢中表达最高,眼睛次之,在肾脏中表达最低。Dvl2和Gsk3β在胚胎的不同发育时期中也出现差异表达模式,两者都在两细胞时期表达最低,在出膜时期表达最强。在眼色素期Dvl2较Gsk3β表达高,神经胚期和肌肉效应期中Gsk3β较Dvl2表达高,在囊胚期、体节期和体色素期表达相近。(5)通过利用一定浓度的镉处理后的二倍体红鲫和三倍体湘云鲫在m RNA水平上均出现不同程度的Gsk3β表达降低,β-catenin表达上调,可见Gsk3β在镉胁迫下可能行使特定的生物学功能,但Gsk3β主要参与两条信号通路,PI3K/AKT信号通路和wnt/β-catenin信号通路,其具体的参与功能及机制还有待进一步研究。以上结果为我们研究低等脊椎动物中Dvl2和Gsk3β基因在Wnt信号转导通路中的具体调控机理以及其对镉胁迫应答的分子机制研究奠定了重要的基础。