论文部分内容阅读
白色念珠菌（Candida albicans）是引起院内严重感染的条件致病真菌之一。而C.albicans所形成的生物被膜,由于可增强其耐药性和免受宿主免疫系统的攻击,致使免疫缺陷人群由于C.albicans感染而带来的危害大大增加。目前两性霉素B等抗生素是临床治疗C.albicans感染的主要药物,但这些药物具有一定的毒副作用,长期使用能增加对肾脏的损伤,因此获得高效、低毒的用于治疗C.albicans感染的临床药物是目前研究的热点。重楼（Paris L）是我国的传统中药,已有的研究结果表明,重楼皂苷有多种药理作用,如抗肿瘤作用和抗真菌作用等。但目前关于重楼皂苷对C.albicans形成的生物被膜的抑制作用研究较少,对其作用机制的研究尚未见相关报道。鉴于重楼皂苷Ⅶ（Polyphyllin Ⅶ）是重楼皂苷的主要有效成分之一,因此本文以Polyphyllin Ⅶ为实验材料,系统地研究了其抑制C.albicans生物被膜形成的作用机制,研究结果如下:（1）通过微量稀释法测定了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans的抑制作用。实验结果显示,Polyphyllin Ⅶ对游离态的C.albicans有显著的抑制作用,其对C.albicans的最低抑菌浓度(MIC80)和最低杀菌浓度（MFC）均为8μg/mL。（2）通过激光共聚焦显微镜检测了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans生物被膜的厚度及细胞活性的影响。实验结果显示,Polyphyllin Ⅶ能降低C.albicans生物被膜的厚度及细胞活性,且呈浓度剂量依赖,即随着药物浓度的增加,C.albicans所形成的生物被膜的厚度越薄,细胞活性越低。其中16μg/mL的Polyphyllin Ⅶ,与对照组相比,能使C.albicans生物被膜的厚度由对照组的53μm减少到18μm,细胞活性降低80%。（3）通过微量稀释法测定了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans成熟生物被膜的抑制作用。实验结果显示,Polyphyllin Ⅶ对C.albicans成熟生物被膜也有显著的抑制作用,其抑制C.albicans成熟生物被膜的MIC80和MFC均为16μg/mL。（4）通过MTT法测定了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans黏附作用的影响。实验结果显示,Polyphyllin Ⅶ能抑制C.albicans的黏附,且呈浓度剂量依赖。其中64μg/mL的Polyphyllin Ⅶ,与对照组相比,可使C.albicans细胞的黏附率降低了65%（P<0.01）。表明Polyphyllin Ⅶ可通过抑制C.albicans的黏附来抑制其生物被膜的形成。（5）通过MTT法及倒置显微镜观察了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans黏附不同时间后的抑制作用。实验结果显示,C.albicans的黏附时间越短,Polyphyllin Ⅶ对其抑制作用的效果越好。其中8μg/mL的Polyphyllin Ⅶ,与对照组相比,对黏附2 h和4 h后的C.albicans的抑制率分别为82%和77%（P<0.01）。表明Polyphyllin Ⅶ对C.albicans生物被膜的抑制作用效果与其黏附的时间长短有关。（6）通过碳氢检验法测定了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans细胞表面相对疏水性（CSH）的影响。实验结果显示,亚抑菌浓度的Polyphyllin Ⅶ可显著降低C.albicans的CSH。其中6μg/mL的Polyphyllin Ⅶ作用菌体48 h后,可使C.albicans细胞表面的相对疏水性,由对照组的0.7降至0.2（P<0.05）。表明Polyphyllin Ⅶ能通过降低C.albicans的CSH来抑制C.albicans的黏附。（7）通过倒置显微镜观察了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans由酵母相向菌丝相转化的影响。实验结果显示,不同浓度Polyphyllin Ⅶ均能抑制C.albicans由酵母相向菌丝相的转化,其中8μg/mL的Polyphyllin Ⅶ能完全抑制C.albicans菌丝的形成。（8）通过RT-PCR法检测了Polyphyllin Ⅶ对C.albicans的黏附基因和菌丝形成基因的影响。实验结果显示,Polyphyllin Ⅶ能显著降低C.albicans生物被膜形成的相关基因的表达水平,且呈浓度剂量依赖。其中8μg/mL的Polyphyllin Ⅶ,与对照组相比,对黏附基因HWP1、ALS3和ECE1的抑制率分别为42%、85%、76.2%（P<0.01）。对菌丝形成基因EFG1和CPH1的抑制率分别为81%和39%（P<0.01）。表明Polyphyllin Ⅶ能通过抑制C.albicans的黏附基因和菌丝形成基因的表达量来抑制其生物被膜的形成。（9）通过倒置显微镜观察了外源添加cAMP后,Polyphyllin Ⅶ对C.albicans菌丝生长的影响。实验结果显示,未添加dbcAMP时,Polyphyllin Ⅶ能抑制C.albicans菌丝的生长,但外源添加dbcAMP后,Polyphyllin Ⅶ对C.albicans的菌丝生长不再有抑制作用,与对照组相比无明显差别。由此推测,Polyphyllin Ⅶ主要是通过阻断cAMP信号通路来抑制C.albicans由酵母相到菌丝相的转变,进而阻止C.albicans生物被膜的形成。