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猪繁殖和呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是危害养猪业最重要的疾病之一,该病引起妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎,仔猪则表现为呼吸障碍。我国丁1995年首次暴发此病,2006年暴发由一种变异的PRRS病毒引起的高致病性猪繁殖和呼吸综合征(HP-PRRS),此病在各年龄猪群中发病率和死亡率都显著升高,给养猪业造成了巨大损失。对于PRRSV变异导致毒力增强的机制,目前还不清楚,因此,在分子水平揭示PRRS病毒毒力增强的机制将对PRRS的有效防控具有重要意义。为研究高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒气(HP-PRRSV)强弱毒之间毒力差异的分子基础,本实验以高致病性猪繁殖和呼吸综合征病毒强毒HuN4-F5株以及由此毒传代致弱的疫苗毒株HuN4-F112为母本,利用反向遗传技术分别将ORFla、ORFlb、ORF2-7在强弱毒间互换,获得以强毒为骨架的拯救病毒rHuN4-F5-ORFla、rHuN4-F5-ORFlb、rHuN4-F5-ORF2-7以及以弱毒为骨架的拯救病毒rHuN4-F112-ORFla、rHuN4-F112-ORF1b、rHuN4-F112-ORF2-7。拯救病毒在体外细胞上生长曲线显示,rHuN4-F5-ORFla的生长滴度明显高于其母源强毒rHuN4-F5, rHuN4-F112-ORF1a的生长明显低丁其母源病毒rHuN4-F112,其它嵌合病毒与其母源毒没有明显差异。进一步将这些嵌合病毒感染30日龄仔猪,结果发现这些病毒均不引起仔猪发热或死亡。测定血清中病毒含量结果显示,rHuN4-F5-ORF1a和rHuN4-F5-ORF1b血清中病毒含量在感染后3、5、7、14天显著低于其母源病毒rHuN4-F5,但rHuN4-F5-ORF2-7血.清中病毒含量仅在感染后第7和14天显著低丁其母源病毒rHuN4-F5。rHuN4-F112-ORFlb和rHuN4-F112-ORF2-7在感染后各时间点血清中的病毒含量与其母源病毒rHuN4-F112无显著差异,而rHuN4-F112-ORFla在感染后后第7天血清中病毒含量显著高于其母源病毒rHuN4-F112。抗体检测结果显示,rHuN4-F5-ORFlb、rHuN4-F5-ORF2-7以及母源病毒rHuN4-F5在感染后第7天血清中的抗体检测呈阳性,明显快丁其他嵌合病毒以及rHuN4-F112。血清中IL-1测定结果显示,rHuN4-F5感染组猪血清中IL-1含量：从感染后第3天开始明显高于其他组,其他组血.清中IL-1含量无明显变化。血清中IL-6检测结果显示,rHuN4-F5组从感染后第3、5、7、14、21、28天血清中IL-6含量显著高于其他组,而rHuN4-F5-ORF2-7组血.清中IL-6含量仅在感染后第3和5天高于除rHuN4-F5组外其他组。IL-10结果显示,rHuN4-F5-ORF1b、rHuN4-F5-ORF2-7以及rHuN4-F5组血清中IL10-含量均有明显升高。rHuN4-F5-ORF2-7和rHuN4-F5组血清中IL-10含量在感染后第3、5、7、14天显著高于其他组。rHuN4-F5-ORFlb组血清中IL-10含量在感染后第5、7、14天显著高于除rHuN4-F5-ORF2-7和rHuN4-F5组以外其他组。以强毒为骨架嵌合弱毒片段的拯救病毒rHuN4-F5-ORF1b和rHuN4-F5-ORF2-7组感染后血清中IL-10含量均较相对应的以弱毒为骨架嵌合强毒片段的rHuN4-F112-ORFlb和rHuN4-F112-ORF2-7组有显著升高,然而rHuN4-F5-ORFla和rHuN4-F112-ORFla组之间则无显著差异。IFN-γ的结果显示rHuN4-F5-ORFla、rHuN4-F5-ORFlb和rHuN4-F5-ORF2-7组血清中IFN-γ含量在感染后第3、5天显著低于其母源病毒rHuN4-F5组。rHuN4-F112-ORFla、 rHuN4-F112-ORFlb、rHuN4-F112-ORF2-7组则与rHuN4-F112组无显著差异。为进一步研究PRRSV ORFlb编码区中三个重要蛋白酶,即：RNA聚合酶(nsp9)、解旋酶(nsp10)、核酸内切酶(nspll)对病毒毒力的影响,利用反响遗传操作技术将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株的非结构蛋白编码区nsp9、nsp10、nsp11分别置换弱毒疫苗株HuN4-F112中的相应片段,获得拯救病毒命名为rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112-nsp10和rHuN4-F112-nsp11。拯救病毒在MARC-145细胞上的生长曲线显示,rHuN4-F112-nsp9和rHuN4-F112-nsp10在前24小时的复制速度明显高于rHuN4-F112-nsp11和拯救的母源毒rHuN4-F112,36小时后无明显差别。将拯救病毒接种仔猪,对体温、临床症状、病毒血症、组织器官病变情况进行观察和检测。结果显示,拯救病毒rHuN4-F112-nsp9、rHuN4-F112-nsp10、rHuN4-F112-nsp11在致病性、发热以及病毒血症强度上与rHuN4-F112无显著差异,提示单独nsp9、nsp10、nspll对病毒致病性以及病毒在体内的复制无影响。本研究结果表明,PRRSV的非结构蛋白区可影响血清中病毒含量以及IL-6、IL-10(?)的产生。非结构蛋白中ORFla可影响抗体的产生、血清中病毒含量以及IL-6、IL-10(?)内产生。ORFlb可影响IL-6的产生,并且具有调IL-10产生时间的作用。单独的nsp9、nsp10、nspll对病毒体内致病性以及复制没有影响,但是nsp9、nsp10可能会提高病毒在细胞上前期的复制水平。本实验为全面揭示PRRSV强弱毒之间毒力差异的分f机制奠定了基础。