目的:随着人们生活水平的提高及不良生活习惯的增多,2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus T2DM)已经成为临床常见疾病,其患病率逐年上升,且发病有明显年轻化的趋势,极大影响人们身体健康,加重社会负担。由于T2DM的病程较长,其慢性并发症可广泛累及心、肝、肾、眼、血管、神经等,其中糖尿病合并肝损伤的发病率正逐年提高。糖尿病相关性肝损伤最常见的表现为非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD),其发病机理尚未系统阐明,目前认为与氧化应激(oxidative stress,OS)、炎症反应、糖脂代谢紊乱、胰岛素抵抗、微循环异常、糖基化终产物等因素密切相关,近年来氧化应激和胰岛素抵抗日益引起了人们的关注。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamyein mTOR)是连接多种信号通路的枢纽,研究证实,高血糖、高血脂等引起的氧化应激可促使mTOR通路过度激活,mTOR通路的过度激活可影响胰岛素信号通路,从而加重糖脂代谢紊乱,促进糖尿病肝损伤的发生。硫辛酸(lipoic aciol,LA)在已知天然抗氧化剂中抗氧化效果最强,其不仅可清除体内的多种反应性氧自由基,而且还能还原人体内的抗氧化系统,增强机体的抗氧化能力,在糖尿病、糖尿病肝损伤的治疗中具有广大的应用前景。本实验制备2型糖尿病大鼠模型,应用硫辛酸干预,实验末检测各组肝脏中mTOR信号通路的标志物mTOR,AMPK磷酸化水平,以探讨α-硫辛酸是否在抗氧化应激的同时抑制糖尿病大鼠mTOR信号通路激活从而发挥肝脏起保护作用。方法:购买22只雄性清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠,鼠龄6周,体重为180g±20g。清洁实验室环境下予普通饲料适应性喂养1周,对22只大鼠应用excel随机数字表法抽取6只作为正常对照组设为A组,抽取8只作为单纯糖尿病组设为B组,余下8中作为硫辛酸组设为C组。对照组继续应用普通饲料喂养,单纯糖尿病组和硫辛酸组用高糖高脂饲料喂养。单纯糖尿病组和硫辛酸组在高糖高脂饲料喂养4周后,一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)30 mg/kg。实验第6周末单纯糖尿病组和硫辛酸组大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)大于等于7.8mmol/L作为2型糖尿病大鼠模型造模成功。硫辛酸组予以100 mg/kg硫辛酸腹腔注射,每日给药1次,连续腹腔注射8周,对照组、单纯糖尿病组均予以等体积生理盐水腹腔注射。实验第14周末:1腹主动脉取血,测定FBG、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷氨酰转肽酶(gammaglutamyl transpeptidase,γ-GGT)、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)等指标,离心后取部分上清液,冻存于-80℃冰箱以备测8-OHdG。2迅速在预冷的分离盘中分离并切取约1mm×1mm×2mm大小的肝脏标本放入的2.5%戊二醛固定液中固定,并置于冰箱中4℃保存,以备电镜观察。3取部分肝脏放于4%多聚甲醛固定,待HE染色观察肝脏形态学变化、免疫组织化学染色检测mTOR通路蛋白表达,且应用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件计算其IOD/Area。4所有实验数据均应用SPSS21.0统计学软件处理完成。对每组数据进行正态性检验后发现数据均服从正态分布资料,以均数±标准差表示。三组数据间两两比较时用单因素方差分析,若满足方差齐性,进行LSD检验,若方差不齐,进行Tamhane’s检验。均以P<0.05为差异有统计学意义,以P<0.01为具有显著性差异。结果:1实验末各组大鼠肝重指数比较糖尿病组和硫辛酸组与正常对照组相比肝重指数明显升高(P<0.05);与糖尿病组对比,硫辛酸组肝重指数明显降低,差异具有统计学差异(P<0.05)。2实验末各组大鼠胰岛素抵抗指数比较糖尿病组和硫辛酸组与正常对照组相比,胰岛素抵抗明显升高(P<0.05);硫辛酸组与糖尿病相比,胰岛素抵抗指数降低(P<0.05)。3实验末各组大鼠生化指标比较糖尿病组、硫辛酸组与糖尿病组相比,FBG明显升高(P<0.05),硫辛酸组与糖尿病组相比,FBG无明显差异(P>0.05);糖尿病组与正常对照组相比,ALT、AST、γ-GT、TG、TC、LDL-C明显升高(P<0.05),HDL-C明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);硫辛酸组与正常组相比,ALT、AST、γ-GT、TG、LDL-C升高(P<0.05),HDL-C降低,差异有统计学意义(P<0.05);硫辛酸组与糖尿病组相比,ALT、AST、γ-GT、TG、TC、LDL-C明显降低(P<0.05),HDL-C升高(P<0.05)。4实验末各组8-OHdG变化单纯糖尿病组8-OHdG水平明显高于对照组(P<0.05);硫辛酸组与正常对照组相比8-OHdG水平稍升高(P<0.05);单纯糖尿病组8-OHdG水平明显高于硫辛酸组(P<0.05)。5肝脏HE染色HE染色光镜下可见正常组大鼠肝组织形态学正常,肝小叶结构完整,肝细胞排列规则,未见脂肪变性及坏死、炎细胞侵润;糖尿病组部分肝细胞发生了脂肪变性,脂滴以大泡型为主,伴有较多的炎性细胞浸润和点状坏死,还可见到血管周围炎及汇管区少量纤维组织增生;硫辛酸组肝细胞脂肪变性明显减少,偶见肝细胞浆内细小脂肪空泡及炎性灶。6肝脏电镜观察电镜下可见:正常组肝细胞核呈圆形或椭圆形,核膜规整光滑,核仁大而园,居于细胞中央,核周隙无扩张,核内染色质分布均匀,线粒体形状正常,粗面内质网分布规律,胞质内几乎见不到或有极少量的脂滴;糖尿病组:细胞核膜边缘不规则,核仁边集,核周隙扩张、不均,线粒体明显增生、肿胀,嵴融合,粗面内质网明显扩张,胞浆内可见大小不一脂肪滴沉积;硫辛酸组:肝细胞核形状大多规则,核间隙基本正常,肝细胞脂肪变性较糖尿病组明显减轻,胞浆内脂滴减少,线粒体肿胀明显好转,线粒体内嵴清楚融合不明显,粗面内质网结构接近正常。7肝脏磷酸化mTOR、AMPK蛋白表达水平糖尿病组磷酸化mTOR、硫辛酸组磷酸化mTOR表达水平较正常组明显增多(P<0.05);硫辛酸组磷酸化mTOR表达水平较糖尿病组明显减少(P<0.05)。糖尿病组磷酸化AMPK、硫辛酸组磷酸化AMPK表达水平较正常组明显减少(P<0.05);硫辛酸组磷酸化AMPK表达水平较糖尿病组明显增多(P<0.05)。结论:1糖尿病组大鼠血清转氨酶升高,镜下观察肝脏出现组织学改变,说明糖尿病大鼠存在肝损伤。硫辛酸干预组肝功能明显改善,肝脏组织学也明显好转,说明硫辛酸具有肝脏保护作用。2糖尿病组大鼠8-OHdG水平明显升高,说明糖尿病大鼠存在氧化应激。硫辛酸干预组8-OHdG水平明显降低,说明硫辛酸具有抗氧化应激作用。3硫辛酸组磷酸化mTOR蛋白表达水平明显减低,磷酸化AMPK蛋白表达水平明显升高,说明硫辛酸对糖尿病大鼠的肝脏保护作用可能与其对mTOR通路异常激活的抑制作用有关。