血细胞输注和造血干细胞移植是临床上治疗严重创伤、恶性血液性疾病、重症再生障碍性贫血、免疫缺陷综合征、地中海贫血等疾病的有效手段。目前血源紧张报道非常普遍,因输血引起的疾病传播严重威胁着人们的健康,在献血志愿者之外寻求安全、可靠、充足、有效的血液来源是从事输血研究工作的科研人员的职责和追求。干细胞领域的研究给人们提供了一个潜在血液替代来源的选择。干细胞具有自我更新和高度分化潜能,可以通过细胞分裂产生表型与基因型完全相同的子细胞以维持自身群体大小,同时又可以进一步分化产生至少一种类型高度分化的子细胞。造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSCs)一直以来是科学家们研究的重要领域之一,很多有关干细胞特性和应用的探讨都是从HSCs深入和拓展的。由于HSCs在机体的比例很低且体外扩增及干性维持困难,其数量成为限制体外诱导成熟红细胞应用的瓶颈。但作为血细胞发育过程中一个关键环节,HSCs对于研究红细胞的定向分化具有非常重要的意义。随着干细胞研究及其相关领域生物学技术的快速发展,尤其是以ES细胞为启动细胞的HSCs工程为临床输血和干细胞的移植带来了新希望。ES细胞具有理论上无限的自我更新和分化为机体所有类型细胞的能力,以ES为启动细胞可使我们可以获得足够的早期造血干/祖细胞进行诱导,从源头上解决体外由人造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSCs)诱导红细胞种子细胞总量不足的问题。由hES细胞诱导红细胞是一个复杂的过程,有许多关键性技术问题需要解决,包括:hES细胞在培养过程中的干性维持,hES细胞向造血干细胞特异性诱导分化及其效率的提高;造血干细胞向红细胞特异性分化体系的优化;红细胞的脱核成熟及功能鉴定;诱导获得的红细胞的安全性评价等。针对如上问题,我们首先建立了一个体外诱导脐带血造血干/祖细胞向红系细胞特异性分化的方法,并通过与特定饲养层细胞共培养,最终得到了脱核的红细胞。与此同时,我们还鉴定了诱导产生的红细胞部分功能和安全性,并在此基础之上,以hES细胞为启动细胞的进行了造血诱导的初步探索,得到了一定比例的造血干细胞,为最终由hES细胞诱导成熟的红细胞奠定了技术基础。本课题研究内容由以下三部分组成。第一部分脐带血造血干细胞的分离、红系诱导分化及脱核首先,我们采用了免疫磁珠分选法,从脐带血单个核细胞(mononuclear cells, MNCs)分离出脐带血HSCs,分离的HSCs占单个核细胞比例为0.82~0.86%,与文献报道的相当,流式细胞术鉴定其纯度在90%以上。我们采取了无血清悬浮培养体系将HSCs向红系特异性诱导。诱导体系内添加了包括干细胞因子(stem cell factor,SCF)、促红细胞生成素(Erythropoietin,Epo)、类胰岛素样生长因子1(Insulin-like Growth Factor I,IGF-1)以及地塞米松(Dexamethasone,DXM)等功能成分。通过7天的诱导,可获得50~70%的红系祖细胞,在诱导10天之后,红系细胞的比例可达90%。经显微镜下形态及生长状态观察、瑞氏——吉姆萨染色、流式细胞术检测细胞表面标志和细胞周期、半固体克隆、RT-PCR检测红系相关基因的表达等方法对其红系分化的效果进行了评估。结果表明,我们实验中所建立的这一方法可以特异性的诱导脐带血造血干细胞向红系细胞定向分化。造血微环境在红细胞的脱核过程中发挥重要作用,而基质细胞则是造血微环境中发挥这种作用的关键的成分之一。人胚胎第9~21周,造血中心转移至肝脏。肝脏是胎儿时期主要的造血器官,以红系造血为主。处于这一阶段的胎肝组织对于造血特别是红系发育具有非常重要的意义。经患者知情同意,我们分离14周龄的人胎肝基质细胞,RT-PCR结果表明,此细胞表达多种促进造血发育的基因,同时还表达TGF-β等促进红细胞成熟的基因。我们以其作为饲养层细胞与红系祖细胞共培养诱导脱核。检测结果表明,在共培养条件下,红系细胞继续分化成熟,晚期红细胞表面标志的表达90%以上,较之于共培养之前显著增加。而瑞氏——吉姆萨染色后观察到的脱核红细胞则直观的证明了本体系可使红系细胞脱核成熟。第二部分诱导分化的红系细胞的功能鉴定血红蛋白(Hb)是红细胞的主要成分,同时也是红细胞运输氧气的功能分子。Hb是红细胞行使功能的结构基础,携氧能力是红细胞行使功能的具体体现。本部分实验中,我们对红细胞气体运输功能进行了检测。随着培养时间的延长,血红蛋白在总蛋白中的比例由诱导之初几乎没有表达升至第5天的2%,第10天6%,之后维持在一个相对稳定的水平,经共培养之后第8天升至10%。说明共培养体系可增加Hb含量,促进细胞的成熟。与此同时,我们以P50仪检测了红系细胞的携氧能力,这一方法也是评价其他红细胞代用品携氧能力的重要方法。结果表明,诱导的红系细胞具有和成体红细胞相似的“S”形氧离曲线,但这一曲线较成人正常红细胞氧离曲线位置偏右,表明体外诱导的红系细胞具有和成熟红细胞相似的携氧能力,但其携氧能力较成熟红细胞偏弱。体外诱导的红细胞最终应用于输血治疗的前提是在细胞体内的能够活存并对机体无害,即对于机体是安全的。鉴于此,我们首先利用非肥胖重度联合免疫缺陷小鼠( nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency disease ,NOD-SCID)为模型,通过小剂量辐照(2.0 Gy)后,将荧光染料羟基荧光素二醋酸盐琥珀亚胺脂(Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester,CFSE)标记胞浆的诱导红系组细胞经尾静脉注射入小鼠体内。结果表明,注射后4小时内,小鼠外周血内可检测到带有标记的细胞,带有标记的细胞比例由注射后2小时0.34%降至4小时0.13%。经30天观察,小鼠的生存状况没有受到影响,所有注射细胞的小鼠在实验过程中均无死亡现象发生。表明,体外诱导的红系细胞在小鼠体内可以活存,对小鼠生存是安全的。在安全性和确保细胞在动物体内活存基础上,为评价诱导的红细胞对小鼠贫血症状的改善作用,我们对C57BL/6小鼠进行腹腔注射苯肼,建立了溶血性贫血模型。最终确定了苯肼致小鼠溶血性贫血发生的最佳作用剂量为1.2mg/10g bw,注射方式为间隔24小时连续两次注射。同时,我们并观察到了苯肼致小鼠溶血性贫血发生发展的规律,为此后对体外诱导的红细胞及其他红细胞代用品的体内功能评价进行了技术储备。通过第一、二部分的实验我们成功的将HSCs诱导成了脱核红细胞,并验证了这群细胞的功能和安全性。由于每一份脐血的量是一定的,脐血中HSCs的比例也是一定的,我们诱导的红细胞的总量受限于每一份脐血中HSCs的量。HSCs数量成为限制体外诱导成熟红细胞应用的瓶颈。随着胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)的分离和成功建系1-3,一种新的潜在的血液来源渐渐走入人们视野。ES细胞具有理论上体外无限扩增并保持未分化状态的能力。越来越多的研究表明,体外可以由ES细胞诱导分化出造血细胞4-25。因此,以ES细胞为启动细胞进行造血诱导,可以从根本上解决体外诱导红细胞生成的过程中种子细胞(造血干/祖细胞)数量的问题。ES细胞将是今后一段时间内体外诱导红细胞的主要选择和趋势。第三部分人胚胎干细胞的培养及造血诱导hES细胞干性的维持需要在特定的饲养层细胞上生长并添加特定的细胞因子。小鼠胚胎成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblasts,MEFs)经γ射线或丝裂霉素C处理终止分裂后可制备成饲养层细胞用于hES细胞的培养。本部分实验中,我们首先分离了制备了MEFs细胞。在此基础之上,启动了hES细胞的培养。hES细胞培养过程中,hES细胞自发分化的发生影响了诱导分化的效率。因此每隔一段时间,都须对培养的细胞进行干性的鉴定。实验中,经免疫荧光方法鉴定表明,培养中的hES细胞细胞干性维持良好,表达SSEA-4、Nanog、OCT-4等hES细胞特异的干性标志,不表达小鼠ES细胞特异性的干性标志SSEA-1。从hES细胞诱导获得红细胞是一个复杂的系统过程,在这一系统过程中,获得足够量源于ES的HSCs是限制最终诱导产生的红细胞数量的瓶颈,目前诱导人ES细胞向造血分化主要有两种方法,分别为基质细胞共培养法和EBs拟胚体方法。拟胚体是指在特定的诱导条件下,ES细胞在悬浮培养条件下聚集分化形成的由三个胚层的细胞组成的囊实相间的立体结构,这其中也包括造血细胞。在EB形成过程中,添加特定的细胞因子可促进hES细胞向某一胚层分化,提高相应胚层细胞的比例。本实验中,我们以无血清培养基为基础培养基,通过添加促进造血发育的细胞因子建立了经EBs诱导hES细胞造血的方法。经RT-PCR检测不同诱导时间EBs中人造血干细胞特异性标记的表达。结果表明,EBs形成第5天开始即有HSCs的标志CD34的表达,流式细胞术检测诱导至第8天的EBs细胞,HSCs的比例接近1%。总结基于本室以往工作的基础和对造血干细胞生物学特性的认识,本研究通过在体外无血清诱导培养基中添加特定的生长因子,诱导脐带血HSCs获得了高纯度的红系祖细胞;通过分离培养人胎肝基质细胞和添加特定功能组分在体外构建类似胎肝的造血微环境,有效促进了红系祖细胞的脱核成熟。同时,体外和体内实验证明这群细胞具有一定的功能,能够在动物体内活存且对动物安全无害。由于体外诱导获得的红细胞的数量由起始HSCs的数量决定的,源于人ES细胞的HSCs使我们可以获得大量的早期造血干/祖细胞进行诱导,从源头上解决体外诱导红细胞种子细胞不足的问题。因此,我们通过拟胚体法诱导人胚胎干细胞造血分化并获得了一定比例的HSCs,为最终从人ES细胞诱导获得红细胞进行了初步尝试。ES细胞是一个理论上无限扩增的干细胞资源,无需捐献者便可获得大规模HSCs用于临床治疗和成熟诱导。以ES细胞为启动细胞的造血干细胞和红细胞诱导代表了今后一段时间的发展方向和趋势,对于输血医学具有里程碑式的意义。