放射治疗随着放射肿瘤学的不断发展,在肿瘤治疗中的地位愈显重要,已成为当今治疗肿瘤最常用的方法之一。放射治疗可以治愈部分肿瘤,但对一些肿瘤,尤其是一些中晚期肿瘤的疗效并不理想,其并发症放射性损伤的发生率也较高。为了解决肿瘤细胞的放射治疗抵抗问题,进一步提高放射治疗的治愈率,临床医生和科学家们通过多项研究和努力,不断的探索出提高放射治疗疗效和降低放射性损伤的新方法。在众多研究中,放射治疗联合肿瘤基因治疗的研究有着极其重要的地位和作用。脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶/氧化还原因子-1(apurinic/aprimidinic endonuclease/ redox factor-1,APE1/Ref-1)是一个双功能生物大分子,在DNA损伤修复和氧化还原作用或氧化还原信号传递过程中起着至关重要的作用。APE1/Ref-1蛋白的不正常表达、分布及功能改变不仅与细胞凋亡、肿瘤发生密切相关,而且修饰APE1/Ref-1活性的早期就可以改变细胞和机体对DNA损伤剂的反应。野生型p53基因是细胞凋亡的关键调控基因,p53基因突变与肿瘤的发生密切相关。基于对上述现状的分析研究,我们提出APE1/Ref-1不仅是肿瘤治疗的靶点而且也是防治放射性损伤的靶点之一。为进一步验证这一设想,本研究分别在体内应用重组腺病毒载体Ad5/F35- APE1/Ref-1siRNA联合人重组腺病毒rAd-p53感染肝癌细胞,通过观察体内肝癌细胞生长的抑制效果,探讨二者联合增强肝癌细胞对放射治疗敏感性的作用机制;同时,利用免疫组化和Western blot方法检测小鼠放射性肺损伤过程中APE1/Ref-1蛋白的表达;在体内应用质粒pcDNA3.1/flAPE1/Ref-1和pcDNA3.1/mtAPE1/Ref-1经尾静脉注射转染小鼠肺组织,观察过表达APE1/Ref-1蛋白对小鼠放射性肺损伤的保护效果,以此探讨APE1/Ref-1对放射性损伤的保护作用;为多基因治疗联合放射治疗肿瘤和防治放射性损伤提供新的实验依据。研究目的1.探讨双功能基因APE1/Ref-1增强肝癌细胞对放射治疗敏感性的作用及其与肿瘤抑制基因p53联合的协同作用;2.研究双功能基因APE1/Ref-1在小鼠放射性肺损伤过程中肺组织中的表达及其与放射性损伤之间的演进关系;3.分析小鼠肺组织过表达APE1/Ref-1蛋白后,APE1/Ref-1对放射性损伤的保护作用及其可能机制。研究内容和方法1.重组腺病毒载体Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA联合人重组腺病毒rAd-p53增强肝癌细胞对放射治疗敏感性的体内实验研究:建立裸鼠人肝癌动物模型,观察Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA联合rAd-p53增强肝癌细胞对放射治疗敏感性的作用,测量肿瘤的生长,绘制肿瘤生长曲线,HE染色,光镜观察肿瘤的组织学变化,免疫组化和TUNEL法检测肿瘤细胞增殖和凋亡。2.APE1/Ref-1在小鼠放射性肺损伤中的表达特点及其意义:建立放射性肺损伤小鼠动物模型,采用HE染色,光镜观察小鼠放射性肺损伤的组织学变化,免疫组化和Western blot检测小鼠放射性肺损伤过程中APE1/Ref-1蛋白表达变化特点,分析APE1/Ref-1表达变化特点与放射性肺损伤的关系,为进一步以APE1/Ref-1为靶点的基因防治放射性损伤提供实验依据。3.APE1/Ref-1过表达对放射性肺损伤的保护作用的实验研究:建立放射性肺损伤小鼠动物模型,观察质粒pcDNA3.1/flAPE1/Ref-1和pcDNA3.1/mtAPE1/Ref-1经尾静脉注射转染小鼠肺组织后,过表达APE1/Ref-1蛋白对小鼠放射性肺损伤的保护效果。采用HE和Masson三联染色,光镜观察小鼠放射性肺损伤的组织学变化,免疫组化和Western blot检测小鼠放射性肺损伤过程中APE1/Ref-1蛋白表达变化,酶联免疫吸附分析法检测血清中TGF-β1水平,分析过表达APE1/Ref-1蛋白对小鼠放射性肺损伤的保护作用。主要研究结果如下:1.重组腺病毒载体Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA联合人重组腺病毒rAd-p53增强肝癌细胞对放射治疗敏感性的体内实验研究:Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA+rAd-p53+IR联合治疗组治疗肿瘤后肿瘤的生长抑制率为93.95%,显著高于对照组和其他治疗组(p均<0.01)。与对照组肿瘤细胞相比,两种腺病毒分别有效抑制了APE1/Ref-1和提高了p53蛋白的表达水平。HE染色观察肿瘤组织学变化显示,各治疗组肿瘤内都出现程度不同的灶性坏死,其中Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA+rAd-p53+IR联合治疗组肿瘤坏死较多,而对照组未见坏死病灶。免疫组化法检测细胞增殖情况显示,Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA+rAd-p53+IR联合治疗组增殖率为(14.70±3.20)%,显著低于对照组和其他治疗组(p均<0.05)。TUNEL法检测细胞凋亡情况显示,Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA+rAd-p53+IR联合治疗组凋亡率为(28.74±1.94)%,显著高于对照组和其他治疗组(p均<0.01)。2.APE1/Ref-1在小鼠放射性肺损伤中的表达特点及其意义:正常小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1呈胞核表达为主,而在小鼠放射性肺损伤不同阶段肺组织上皮细胞和内皮细胞中APE1/Ref-1表达特征有所改变,呈核浆共同表达和胞浆表达为主;并且APE1/Ref-1表达呈现先增高后降低的趋势,照射后1d开始升高,3d达高峰,约是对照组2.2倍,此后随着小鼠放射性肺损伤发展逐渐降低,28d降至对照组水平,56d明显低于对照组,约是对照组0.2倍。3.APE1/Ref-1过表达对放射性肺损伤的保护作用的实验研究:质粒pcDNA3.1/flAPE1/Ref-1和pcDNA3.1/mtAPE1/Ref-1均能经尾静脉注射转染小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞,使其过表达APE1/Ref-1,转染后三天,小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞APE1/Ref-1蛋白明显增加,分别是对照组2.3倍和2.8倍。小鼠全胸单次受到致放射性肺损伤20Gy剂量的X线照射后,过表达APE1/Ref-1的小鼠肺组织病理学形态和Masson染色显示其放射性肺损伤在各个检测时间点均较单纯照射的小鼠有所改善:单纯照射组的小鼠肺组织在照射后1、3、7、14d病变以渗出为主,肺间质及肺毛细血管充血、水肿,肺泡腔及细支气管内见较多的淋巴细胞浸润,间质水肿致肺泡壁轻度增厚,部分肺泡间含水肿液;28、56d病变以慢性炎症为主,支气管和血管周围可见以淋巴细胞为主的炎症细胞浸润,肺泡壁增厚肺泡腔变小,肺泡间隔及部分肺泡腔内可见纤维素样的渗出物;纤维组织在照射后14d开始增生,28、56d肺纤维化形成,肺结构紊乱,并可见大量染成绿色的胶原纤维。而过表达APE1/Ref-1小鼠的肺组织照射后病变以渗出为主,在病变的程度、纤维组织的增生、肺纤维化的形成以及肺结构紊乱均轻于单纯照射组小鼠。血清转化生长因子TGF-β1在小鼠照射后7d含量明显增高,此后逐渐增高,56d达高峰;过表达APE1/Ref-1小鼠血清TGF-β1含量也逐渐增加,但与单纯照射组小鼠相比血清含量显著降低(p<0.05)。结论1. Ad5/F35-APE1/Ref-1siRNA联合rAd-p53能增强肝癌细胞对放射治疗的敏感性,抑制肿瘤生长作用显著增强,以APE1/Ref-1和p53为靶点的多基因治疗联合放射治疗可能成为今后肝癌治疗的新方法。2.电离辐射可以刺激小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞APE1/Ref-1蛋白的表达并使其表达发生由核内转向浆内和先增高后降低的特征改变,提示APE1/Ref-1可能在放射性肺损伤修复过程中起着重要作用。3.质粒pcDNA3.1/flAPE1/Ref-1和pcDNA3.1/mtAPE1/Ref-1均能经尾静脉注射转染小鼠肺组织上皮细胞和内皮细胞,使其过表达APE1/Ref-1。4. APE1/Ref-1过表达对小鼠放射性肺损伤有一定程度的保护作用,其机制可能是通过APE1/Ref-1在细胞DNA损伤修复和氧化还原调节中的特殊作用修复受损的细胞DNA,抑制活性氧产生及其活性,降低细胞因子TGF-β1的表达,减少胶原蛋白的形成,使放射性损伤病变减轻。