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目的:以不经过免疫磁珠分选(Magnetic Activated Cell Sorting,MACS)和富集的初治高白细胞血症急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)患者的骨髓血单个核细胞(CD34~+细胞比例为(79.32±5.98)%)作为初始培养细胞,应用两组不同的细胞因子组合,建立CD34~+细胞向自然杀伤细胞(Natural killer cell,NK细胞)转化的体外培养体系,比较两组细胞因子组合诱导分化作用的异同。研究联合应用重组人白细胞介素12(recombinant human interleukin-12,rh IL-12)、重组人白细胞介素15(recombinant human interleukin-15,rh IL-15)对NK细胞的分化、增殖、细胞活性、细胞毒作用以及Granzyme B、TNF-α、IFN-γ等基因的表达的作用,探讨联合应用IL-12、IL-15在诱导CD34~+细胞向NK细胞转化中的作用及优势。方法:1提取骨髓血单个核细胞(Bone Marrow Blood-Mononuclear Cells,BM-MNC)以6位白细胞计数≥100×10~9/L的初治急性髓系白血病患者为研究对象(患者均签署知情同意书),取其骨髓血约5ml,肝素抗凝,应用Ficoll-Hypaque淋巴细胞分离液(相对密度1.077)密度梯度离心法分离得到骨髓血单个核细胞,流式细胞仪检测CD34~+细胞和CD3-CD56~+NK细胞比例,同时检测CD69以及NKp46、NKG2D的表达情况作为对照。同时将一部分单个核细胞冻存于液氮中,作为靶细胞以及PCR对照组细胞备用。2体外建立NK细胞诱导体系应用RPMI l640完全培养基(含1%青霉素和链霉素,1m M L-谷氨酰胺和10%热灭活胎牛血清)混匀得到的单个核细胞,调整其细胞密度为2×10~5/ml,接种于50ml细胞培养瓶,每瓶中加入细胞悬液5ml。根据不同的细胞因子组合,实验共分为2组:A组(SCF、IL-7、IL-12、IL-15);B组(SCF、IL-7、IL-2、IL-15)。所加入细胞因子的浓度为:SCF、IL-7、IL-15均为20ng/ml,IL-12为2ng/ml,IL-2为1000U/ml。将细胞培养瓶置于37℃、含有5%CO2的饱和湿度细胞培养箱中培养5周,每周全量换液及补充细胞因子。3 NK细胞增殖情况检测每周各取A、B组1ml细胞悬液,应用细胞计数板计算细胞密度,并计算A、B组细胞总数。应用流式细胞仪检测CD3-CD56~+NK细胞比例,进而计算A、B组总细胞中CD3-CD56~+NK细胞比例。5周诱导分化结束时,同时检测A、B组中CD34~+细胞比例。4检测各组NK细胞活化情况应用流式细胞仪,检测诱导分化5周的A、B组NK细胞活化标志CD69分子的表达情况,以及NK细胞表面活化性受体NKp46、NKG2D的表达情况。5应用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,q PCR)(2(?)相对定量法)检测相关基因表达情况检测诱导分化5周的A、B组NK细胞Granzyme B、TNF-α、IFN-γ基因的表达水平,同时检测培养前冻存的患者骨髓血单个核细胞上述基因表达水平作为对照。6应用CCK-8试剂盒检测NK细胞杀伤活性以诱导分化5周的A、B组NK细胞为效应细胞,以K562细胞和冻存的患者骨髓血分离的单个核细胞(患者来源白血病细胞)分别作为靶细胞,应用CCK-8试剂盒检测效靶比为1︰1、5︰1、10︰1时的杀伤率。结果:1 6位初治急性髓系白血病患者白细胞计数为(122.50±15.98)×10~9/L,经流式细胞仪检测,其骨髓血单个核细胞中CD34~+细胞比例为(79.32±5.98)%,NK细胞比例为(0.45±0.19)%,CD56~+CD69~+细胞比例为(0.67±0.15)%,CD56~+NKp46~+细胞比例为(0.34±0.21)%,CD56~+NKG2D+细胞比例为(0.31±0.12)%。2经5周诱导分化后,A组CD3-CD56~+NK细胞比例为(71.22±2.25)%,B组为(56.32±3.97)%,两组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。A组CD34~+细胞的比例(0.06±0.06)%,B组为(0.08±0.07)%。以上数据说明,两组细胞因子组合均可将骨髓血CD34~+细胞体外诱导分化为NK细胞,诱导分化5周时A、B组中几乎不含CD34~+细胞,与IL-2、IL-15组相比,联合应用IL-12、IL-15组可以显著提高NK细胞的转化率。3 5周诱导分化结束,A组细胞总数为(1.53±0.17)×10~8,B组细胞总数为(1.37±0.13)×10~8,培养前各组细胞总数相等,为1×10~6,培养后A组细胞扩增了153±17倍,B组细胞扩增了137±13倍,两组比较差异不具有统计学意义(P>0.05)。说明联合应用IL-12、IL-15组和联合应用IL-2、IL-15组在提高NK细胞增殖能力方面无显著差异。4 NK细胞活化标志CD69~+表达比例为:A组(70.72±3.62)%;B组(59.98±2.86)%,组间比较差异具有统计学意义(P=0.000<0.05)。NK细胞表面活化受体的表达比例为:NKp46~+:A组(70.30±3.45)%;B组(60.38±2.84)%,差异比较具有统计学意义(P=0.001<0.05)。NKG2D+:A组(72.75±3.89)%;B组(62.30±4.25)%,差异比较具有统计学意义(P=0.002<0.05)。以上结果说明,两组细胞因子组合均可显著促进NK细胞活化,与IL-2、IL-15组相比,联合应用IL-12、IL-15组诱导分化的NK细胞具有更高的活性,具有更好的生物学效能。5 PCR结果A、B组NK细胞Granzyme B、TNF-α和IFN-γ基因的表达水平较冻存的患者骨髓血单个核细胞显著升高。Fold Change(F值):Granzyme B:A组为(13.36±1.54),B组为(9.82±1.21),组间差异比较具有统计学意义(P=0.001<0.05);TNF-α:A组为(9.38±0.51),B组为(7.06±0.52),组间差异比较具有统计学意义(P=0.002<0.05);IFN-γ:A组为(6.26±0.25),B组为(4.28±0.23),组间差异比较具有统计学意义(P=0.000<0.05)。以上结果说明,两组细胞因子均可促进NK细胞上述基因的表达,与IL-2、IL-15组相比,联合应用IL-12和IL-15可以显著提高NK细胞上述基因的表达,可提高NK细胞分泌相关细胞因子的能力。6 CCK-8杀伤实验结果A、B两组NK细胞对K562细胞的杀伤率在效靶比为10︰1时最高,A组为(62.20±2.36)%,B组为(56.77±3.81)%,组间比较差异具有统计学意义(t=3.803,P=0.013<0.05)。A、B两组NK细胞对患者骨髓来源白血病细胞的杀伤率亦在效靶比为10︰1时最高,A组为(70.78±2.54)%;B组为(62.95±1.94)%;组间比较差异具有统计学意义(t=7.900,P=0.000<0.05)。以上结果表明:两组诱导分化的NK细胞对白血病细胞均具有杀伤作用,与IL-2、IL-15组相比较,联合应用IL-12、IL-15组可以显著提高NK细胞的杀伤活性。在相同效靶比时,A、B两组NK细胞对患者来源白血病细胞的杀伤率显著高于K562细胞,差异比较具有统计学意义(P<0.05),说明诱导分化的NK细胞对白血病细胞的杀伤可能具有同体特异性。结论:1初治高白细胞血症急性髓系白血病患者的骨髓血CD34~+细胞可在体外诱导分化为CD3-CD56~+NK细胞,且具有杀伤活性。2在诱导NK细胞增殖方面,联合应用IL-12、1L-15组与IL-2、IL-15组相比较差异无统计学意义。3联合应用IL-12、1L-15组诱导分化的NK细胞活性、对白血病细胞的杀伤率以及Granzyme B、TNF-α和IFN-γ基因的表达水平均显著高于IL-2、1L-15组,差异比较具有统计学意义。4两组诱导分化后的细胞中几乎不含CD34~+细胞,诱导分化的NK细胞对患者来源白血病细胞的杀伤率均显著高于K562细胞,说明细胞因子诱导分化的NK细胞对白血病细胞的杀伤具有同体特异性。