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毕赤酵母表达系统广泛应用于重组蛋白的表达，目前已经成为最为常用的真核表达系统之一。但是与其他表达系统比较，毕赤酵母中已经开发并用于重组蛋白表达的启动子数量有限。目前最常用启动子为AOX1启动子，PAOX1非常高效，受甲醇碳源激活，葡萄糖、甘油、乙醇等碳源严格阻遏。但是除了几个已知的转录因子外，PAOX1的调控机制还不甚明朗，因此本课题基于转座子标签突变技术，筛选并研究了与PAOX1的转录调控和过氧化物酶体合成相关的基因。此外由于甲醇有毒易燃等特性限制了毕赤酵母表达系统在食品医药行业以及工业上的大规模应用，本课题也尝试在毕赤酵母中鉴定更多的组成型或碳源特异性诱导型启动子。 首先为了更好地研究PAOX1的调控机制，利用FLD1基因缺失后菌株在高甲醇浓度下甲醛氧化为甲酸的途径被抑制，从而积累过多甲醛最终致死的特性，利用转座子突变质粒PMSBHis4MazfARS对GS115-△FLD1进行随机突变。如果突变的基因是AOX1启动子的转录激活因子或过氧化物酶体合成的相关基因，则该菌株Aox酶合成受阻，不会代谢甲醇，即使在高甲醇的条件下也不会积累甲醛致死，如果向培养基中添加非抑制的碳源山梨醇，那么菌株可以利用山梨醇进行生长;而其他的突变菌株由于依然可以合成Aox酶，仍然会代谢甲醇，积累大量甲醛而致死。利用这样的原理，最后筛选到7个在高甲醇浓度下依然可以生长的突变株，通过Aox酶活显色，发现其中两个显色反应明显变弱，通过Tail-PCR测序比对，其中一个是与过氧化物酶体形成有关的基因PEX30，另一个是功能未知的基因PAS_chr1-4_0251。 另一方面，通过比较毕赤酵母野生型菌株在葡萄糖、甘油和甲醇三种不同碳源条件下的转录组数据，找到在不同碳源下表达差异较大的基因，结合各自RNA折叠结构和吉布斯自由能大小(△G)，挑选出在不同碳源中表达强度差异较大的启动子，通过绿色荧光蛋白GFP和重组高温淀粉酶对启动子强度进行鉴定，最终鉴定到两个较有潜力的新型启动子可以应用到重组蛋白表达:分别是甲醇诱导型启动子P0547和组成型启动子P0472。