共生固氮结瘤是豆科植物与根瘤菌两者相互作用的结果。从根瘤菌接触根毛至形成成熟根瘤的过程,其实就是根瘤菌和宿主植物的有关基因的表达及其基因表达产物之间相互作用的过程。这个过程涉及根瘤菌与植物两者之间的分子对话、相互识别、信息传导和基因表达的复杂网络调控。如果能把这个过程的各个环节诠释清楚,不但可以改善或促进豆科植物的共生固氮,而且有可能在非豆科植物,特别是主要农作物上实现共生固氮,从而提高农作物的产量与品质,大大缓解在氮肥生产和施用过程造成的资源紧缺和环境污染的压力,造福于人类。目前研究已经证明,植物凝集素在豆科植物识别根瘤菌的过程中起着不可缺少的重要作用,通过豆科植物间凝集素基因的转化,可使一些豆科植物识别原本不能识别的根瘤菌。一种植物在不同的生态环境可与多种根瘤菌共生,说明豆科植物与根瘤菌共生的多样性,这也修正并发展了传统的根瘤菌寄主专一性和植物互接种族的概念。Edwards等(1991)和H(?)fte等(1991)分别将豌豆凝集素转入到马铃薯、烟草中;王逸群、荆玉祥(1999)进行了豆科植物凝集素基因和植物血红蛋白基因双价基因的植物表达载体的构建,并分别转化到烟草和水稻,研究凝集素在转基因植株中的细胞生物学定位及其表达机制,以期最终能实现将豆科植物凝集素基因转化到非豆科植物,并能使非豆科转基因植株识别相应的根瘤菌,通过凝集素基因扩大根瘤菌宿主范围。共生固氮体系中,在宿主植物内部有一类基因在根瘤菌入侵根毛到固氮根瘤的形成过程中表达,被称之为结瘤素基因(Nodulin Gene),并依表达时间先后而分为早期结瘤素基因和晚期结瘤素基因。早期结瘤素基因在根瘤发育早期表达,参与“根瘤菌—根毛”相互作用及根瘤形态发生过程,对植物与根瘤菌之间的信息传递、根瘤菌的侵染及根瘤的形成有着重要作用。到目前为止,越来越多的早期结瘤素基因已经被鉴别出来,并得到克隆和测序,但是人们对这些基因作用机理的研究还不是很透彻,也需要探讨将这些早期结瘤素基因从宿主豆科植物转移到非豆科植物后的功能与作用。本研究通过特异引物、PCR技术从豌豆基因组DNA中克隆出早期结瘤素基因PsENOD12A、PsSym7、PsSym35,并将豌豆早期结瘤素基因PsENOD12A和凝集素基因(psl)构建成了植物双元表达载体pVCT2120,用农杆菌介导法转入烟草。主要实验结果如下:1.克隆了豌豆早期结瘤素基因PsENOD12A以豌豆基因组DNA为模板,利用特异引物和PCR技术,扩增获得PsENOD12A基因。序列分析表明,该基因全长1282 bp,含有编码110个氨基酸的333 bp的开放阅读框和936 bp的5’端控制区。与GenBank公布的已知序列(X81306)相比,其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为99.9%(仅有1个碱基不同)和100%。2.克隆了豌豆早期结瘤素基因PsSym7以豌豆基因组DNA为模板,利用兼并引物和PCR技术,扩增获得PsSym7基因片段,该基因片段长743bp。通过用Geneious Pro tril 4.5.4进行在线分析比对,发现它与编码GARS蛋白家族的豌豆Sym7基因(登录号AJ832139)核苷酸同源率达99.1%。该基因片段推导的蛋白序列长度约为248个氨基酸,用Geneious Pro tril 4.5.4进行在线分析比对,发现它与豌豆GRAS蛋白家族(网上登录号为CAH55769)的序列同源率达99.8%。3.克隆了豌豆早期结瘤素基因PsSym35以豌豆基因组DNA为模板,利用特异引物和PCR技术,扩增获得PsSym35基因。由于该基因大于5kb,因此分两段克隆该基因,然后进行拼接。PsSym35up(promoter区域)长为838bp,PsSym35down(CDS区域)长为3199bp。用Geneious Pro tril 4.5.4进行分析,该基因有3个内含子。与GenBank上公布的豌豆PsNIN基因(AJ493063)相比,同源率为99.9%,将由克隆的PsSym35基因推导的蛋白质与公布的豌豆结瘤过程早期的蛋白(NCBI登录号CAD37946)比对,同源率为98.7%。4.将PsENOD12A与PsLectin两个基因导入了烟草基因组先将PsENOD12A连接到中间载体pVCT2020上,构建成pVCT2020-12A,再与植物表达载体pVCT2020-PsL进行重组,构建成pVCT2120双元表达载体。利用农杆菌介导法将PsENOD12A与PsLectin两个基因导入烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Wisconsin38)中。共获得8个独立的卡那霉素抗性烟草株系,移栽后全部成活并开花结果。PCR检测初步确定PsENOD12A基因和psl基因已整合进烟草基因组。