支气管哮喘(简称哮喘),是一种复杂的慢性气道疾病,以持续的气道炎症和气道高反应性为特点。在哮喘气道炎症中,多种细胞及细胞因子参与其中,如嗜酸性粒细胞、肥大细胞、T淋巴细胞、中性粒细胞等。其中,CD4+T淋巴细胞家族被证实是哮喘免疫学发病机制的重要效应细胞,其各亚群均发育于同一前体细胞-Th0细胞(又称初始CD4+T细胞),最经典的Th1/Th2细胞亚群数量与功能失衡即Th2型应答优势化早已被公认为过敏性哮喘的重要发病机制。在过敏性哮喘中,被激活的Th2细胞产生大量的细胞因子如IL-4、IL-5等,而这些细胞因子在诱导气道嗜酸性粒细胞炎症中发挥主导作用。Th17细胞,是近年新发现的、不同于Th1/Th2细胞亚群的CD4+T细胞家族成员,在机体炎症反应和免疫应答尤其是自身免疫方面发挥重要作用。在CD4+T细胞家族中,类似于Th1/IFN-γ,和Th2/IL-4,IL-17为Th17细胞的身份标识因子,也是代表性的细胞因子。实验发现Th17/IL-17也参与了过敏性哮喘的发病,但具体机制至今不完全清楚。ANP (atrial natriuretic peptide)-心房利钠肽,又名心钠素,源于ANP激素原(pro-ANP),最早从心房组织分离鉴定的多效能血管活性肽,因具有扩血管、利钠、利尿等作用而闻名。其实,肺脏是除心血管系统外重要的ANP合成部位,同时也是ANP的靶器官之一。研究表明ANP广泛存在于外周肺组织、气管上皮细胞、呼吸上皮、人胎肺组织等部位；通过放射核素定位和免疫细胞化学证实,肺部支气管上皮和肺泡细胞均存在ANP的效应受体NPRA (natriuretic peptide receptor A)及其清除受体NPRC (natriuretic peptide receptorC)；人、猪、鼠的肺部均表达NPRA及NPRC;而且与肾脏和肝脏组织匀浆相比较,肺组织匀浆能更大程度的通过中性肽链内切酶降解pro-ANP。上述ANP、高亲和性ANP作用受体及大量降解ANP的酶的存在,表明肺不仅仅是ANP的靶器官,它自身亦拥有着完善的ANP代谢系统,而不只是依赖于循环中的ANP。这暗示ANP信号可能在肺部生理、病理过程中有着不可忽视的作用。然而,迄今为止,关于ANP信号在肺部的生理病理学功能知之甚少。其实,ANP信号除了其经典的调节机体容量-压力内稳态作用外,越来越多的证据表明ANP信号在炎症和免疫反应方面也可能发挥重要作用。如在猪、小鼠、大鼠的胸腺、脾脏、淋巴结里存在ANP激素原；在人、鸟、小鼠的胸腺和扁桃体均能测出ANP mRNA; ANP信号可抑制胸腺细胞的增殖和分化；体外实验发现ANP可以剂量依赖方式诱导腹腔肥大细胞释放组胺；ANP信号还可影响中性粒细胞、巨噬细胞及树突状细胞的功能活性等。此外,T淋巴细胞亦可表达ANP的作用受体NPRA。这些都说明了ANP信号确实与炎症反应与免疫应答密切相关。有临床观察发现在哮喘患者急性发作期,外周血ANP水平较缓解期和正常人均有明显的升高,这提示ANP信号可能与哮喘发病相关,但其在哮喘发病中的具体效应及作用机制尚不明确。基于前述,我们提出假说：既然哮喘患者外周血中ANP水平有明显异常的变化,而且ANP信号也与免疫炎症反应密切相关,那么ANP信号是否有可能通过调节CD4+T细胞的功能活性而参与过敏性哮喘的发病呢?本课题将以小鼠脾源性CD4+T细胞和过敏性哮喘小鼠模型作为研究对象进行观察以期达到以下研究目的：一、研究ANP信号是否调控CD4+T细胞的功能活性及其可能的作用通路；二、观察ANP信号是否通过调控CD4+T细胞功能活性而参与过敏性哮喘的发病。首先,利用免疫磁珠分选法获取纯化的小鼠脾脏CD4+T细胞行体外研究,观察ANP信号对CD4+T细胞分化及功能的调控作用；其次,利用小鼠成功建立过敏性哮喘模型,进行在体干预ANP信号后,观察对哮喘小鼠模型气道炎症及CD4+T细胞相应转录因子及细胞因子等的影响,初步阐明ANP信号通过调控CD4+T细胞功能活性而参与过敏性哮喘的发病,也为认识ANP信号在其他肺部疾病的作用提供参考。第一章ANP信号对Th17细胞分化和功能的作用研究目的(1)体外观察ANP信号对Th17细胞分化和功能的影响；(2)探讨ANP调控Th17细胞的信号通路。方法(1)无菌提取BALB/c小鼠脾脏,充分研磨制备单个核细胞悬液；(2)利用MACS技术获取纯化的CD4+T细胞,计数并测定细胞活力；(3)按原液组、定向分化未干预组(简称分化组)、定向分化+ANP组(简称ANP组)、定向分化+A71915(ANP/NPRA信号抑制剂)+ANP组(简称A71915组)及定向分化+KT5823(NPRA受体偶联PKG激酶的抑制剂)+ANP组(简称KT5823组)培养4天；(4)干预ANP信号后,检测第二信使cGMP水平变化；定向分化培养4天后,流式检测IL-17+-CD4+T细胞(Thl7)数量、Western-Blot(WB)检测各组中Thl7细胞转录因子水平(RORyt及BATF)及ELISA检测培养上清液中细胞因子IL-17的变化。结果(1)相较于原液组,anti-IFN-y抗体、anti-IL-4抗体、TGF-β1、IL-6及IL-23细胞因子组成的定向分化诱导微环境能明显的诱导Th0细胞定向分化为Th17细胞,同时伴随着细胞因子IL-17量的明显增加(P<0.01)：(2)相较于定向分化组,加入ANP后可抑制Th17细胞的分化数量且伴随着Th17细胞特异性转录因子RORγt及BATF表达下降与培养上清液中细胞因子IL-17含量的减少(P均<0.05),并呈现浓度依赖性(10-8-10-6M)(P<0.05)；(3)提前加入ANP/NPRA抑制剂-A71915(10-6M)后,ANP对Th17细胞分化和功能的抑制效应被明显的阻断(P均<0.05)；(4)同样,提前加入NPRA受体偶联的PKG激酶抑制剂-KT5823同样可抵消ANP对Th17细胞分化和功能的影响(P均<0.05)；(5)ANP信号的干预变化均导致与NPRA耦联的第二信使cGMP水平的相应变化(P均<0.01)。结论(1)在体外,ANP信号可抑制Th17细胞的分化和功能,并呈浓度依赖性；(2)NPRA-PKG信号通路在ANP调控Th17细胞分化和功能的过程中发挥重要作用。第二章ANP信号对Th17/IL-17的影响及其在过敏性哮喘小鼠模型的作用探讨目的(1)建立并评估OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型；(2)观察ANP及其受体NPRA在过敏性哮喘小鼠模型中的变化；(3)观察ANP信号对过敏性哮喘小鼠模型气道炎症及肺组织中Th17细胞特异性转录因子蛋白表达和肺局部IL-17水平的影响。方法取40只SPF级BABL/c雌性小鼠,按在体实验目的随机分为五组：正常组、哮喘未干预组(简称哮喘组)、ANP雾化吸入组(简称ANP组)、ANP雾化吸入+A71915腹腔注射组(简称ANP+A71915组)及A71915腹腔注射组(简称A71915组),每组8只。利用10μgONA/只+0.2ml Al(OH)3/只腹腔注射致敏、5%OVA溶液雾化激发模拟建立过敏性哮喘模型,同时正常组则以等体积的PBS代替OVA行致敏、激发；ANP组在每次雾化OVA溶液前30min给予ANP干粉溶液(浓度为1μg/g小鼠)雾化吸入；ANP+A71915组则在每次雾化ANP干粉溶液前30min予以腹腔注射ANP信号的抑制剂-A71915(浓度0.5μg/g小鼠)；而A71915组即OVA雾化激发前30min腹腔注射A71915,其余操作同哮喘未干预组。致敏和雾化激发过程中注意观察记录小鼠的一般行为活动。完成最后一次激发24h后处理所有小鼠,实验内容包括：(1)麻醉小鼠,通过气管插管吸入不同浓度的乙酰甲胆碱溶液后,有创肺阻抗法测定各组小鼠的气道反应性(RL及Cdyn)变化；(2)利用支气管肺泡灌洗法收集支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid-BALF)行细胞总数计数及分类计数,并检测BALF上清液中ANP、IL-4及IL-17的含量；(3)肺组织病理学观察分析；(4)Western-blot (WB)检测正常与哮喘组小鼠肺组织和脾源性CD4+T细胞中ANP效应受体-NPRA的变化；(5)WB测定肺组织Th17细胞特异性转录因子RORyt/BATF表达水平的变化及肺组织匀浆上清液ANP. IL-4及IL-17的含量。结果(1)哮喘组及其他三个药物干预组小鼠在雾化激发时均有不同程度的哮喘样发作症状,如身体蜷缩、烦躁不安、挠耳抓鼻、呼吸急促、大小便失禁等表现,而正常组则表现基本正常,建模和在体干预过程中未出现小鼠死亡现象；(2)与正常组比较,哮喘组的肺阻力(RL)对不同浓度的乙酰甲胆碱(Mch)反应曲线明显上移(P<0.01)；同时肺动态顺应性(Cdyn)则明显下移(P<0.01),提示成功模拟过敏性哮喘的气道高反应性；(3)相较于正常组,(?)ANP+A71915及A71915组的肺功能检测发现气道高反应性仍存在(P均<0.05),但较哮喘组有所缓解(P均<0.05)；而ANP组小鼠的肺阻力和肺动态顺应性无显著变化,接近于正常组水平(P均>0.05)；(4)哮喘组的BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等分类计数均明显高于正常组(P均<0.01)；然而ANP组BALF中细胞总数计数及分类计数不仅明显高于正常组(P均<0.01),甚至还高于哮喘组(P均<0.05)；A71915组则较哮喘组明显减少(P<0.05)；而A71915+ANP组中细胞总数及嗜酸性粒细胞计数较ANP组减少(P均<0.05)；(5)相较于正常组,哮喘组BALF上清液中IL-4水平明显升高(P<0.01),IL-17含量亦增加(P<0.01)；ANP组BALF中IL-4水平升高更显著(P<0.01),甚至高于哮喘组(P<0.05),但未见IL-17水平的明显下降(P>0.05)；在A71915组,IL-4、IL-17水平相比于哮喘组均下降(P均<0.05)；A71915+ANP组较ANP组IL-4有所下降(P<0.05)但IL-17变化亦不显著(P>0.05)；(6)与正常组比较,哮喘组小鼠BALF及肺组织匀浆上清液中ANP的含量均升高(P均<0.01)；(7)哮喘组小鼠肺组织中ANP作用受体NPRA表达水平较正常组明显升高(P<0.05)；而且,哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中NPRA的表达亦高于正常小鼠(P<0.05)；(8)与正常组相比,哮喘组支气管-肺组织病理学检测发现支气管及血管周围分布着大量的炎症细胞(炎症评分,P<0.01),并且PAS染色可见气道上皮周围有许多的粘液分泌(粘液评分,P<0.01)。而吸入ANP后,支气管及血管周围的炎性细胞浸润及粘液分泌程度比哮喘组更严重(P<0.05)；ANP+A71915组较ANP组均有所缓解(P均<0.05)；A71915组则较哮喘组明显改善(P均<0.01)；(9)与正常组比较,哮喘组小鼠肺组织中Th17细胞转录因子RORyt及BATF均表达升高(P均<0.05)；吸入ANP后肺组织中RORyt及BATF的表达则较哮喘组有所下降(P均<0.05)；而阻断ANP信号即使用A71915后,RORyt的表达情况有所逆转(P<0.05)但BATF的表达差异无统计学差异(P>0.05)；(10)各组肺组织匀浆上清液中IL-4、IL-17水平的变化趋势则与BALF中的测定结果基本一致。结论(1)过敏性哮喘小鼠模型建立成功；(2)ANP信号参与了过敏性哮喘的发病；(3)ANP信号可缓解过敏性哮喘的气道高反应性；(4)ANP信号虽可下调肺局部Th17细胞RORyt及BATF转录因子的表达,但IL-17水平变化不明显；虽与体外观察结果不完全一致,但仍可能是ANP信号加剧过敏性哮喘气道炎症的机制之一；(5)ANP信号加重过敏性哮喘气道炎症反应。第三章ANP信号对Th1/Th2细胞功能平衡的影响及其在过敏性哮喘气道炎症中的作用探讨目的(1)体外观察ANP信号对Th1/Th2细胞功能平衡的影响；(2)结合在体实验,初步探讨ANP信号通过促进Th2细胞功能优势化而加重过敏性哮喘气道炎症。方法无菌提取哮喘小鼠脾脏并研磨分离制备单个核细胞悬液后,利用免疫磁珠阳性分选获取脾源性CD4+T细胞行体外干预实验。计数、测定活力后按一定比例接种培养。依不同的试剂干预分为原液组、ANP组、SNP+A71915组。加入ConA(终浓度为5μg/m1)刺激培养24小时后收集细胞。Western-Blot法检测T-bet/GATA3蛋白的表达变化,ELISA法测定培养上清液中IFN-y/IL-4因子含量以评估ANP信号对Th1/Th2细胞功能平衡的影响。在体实验方面,各组小鼠接受最后一次激发结束24h后取肺组织,测定其中Th1/Th2细胞特异性转录因子T-bet/GATA3蛋白表达有无变化及BALF与肺组织匀浆上清液中IFN-y水平的含量变化测定,在体实验操作均与第二章实验同步开展。结果(1)相较于正常组,哮喘组小鼠肺组织中GATA3表达明显增高(P<0.05)；而且相较于哮喘组,ANP吸入组小鼠肺组织中GATA3蛋白表达更明显(P<0.05),相反T-bet表达则下降(P<0.05)；阻断ANP信号(A71915)后,转录因子GATA3表达有所下降(P<0.05),而T-bet的表达则有所恢复(P<0.05)；(2)与哮喘组比较,ANP组肺组织匀浆上清液中与T-bet表达变化基本一致(P<0.05),但BALF中IFN-y水平变化不明显(P>0.05)；在A71915+ANP组中变化也不显著(P>0.05)；(3)在体外干预哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞实验中,加入ANP刺激后,相较于原液组,GATA3蛋白表达亦增加(P<0.05),同时伴随T-bet的表达下降(P<0.05),变化趋势基本同在体肺组织中的观察结果；而提前加入ANP信号抑制剂A71915后,GATA3/T-bet的变化趋势则被逆转(P<0.05)；(4)相比较于原液组,ANP组细胞培养上清液中IL-4水平升高(P<0.05),而IFN-γ减少(P<0.05)；而提前加入拮抗剂A71915后,IL-4及IFN-γ含量的变化趋势与ANP组比较均有所恢复(P<0.05)。结论(1)在体外,ANP信号影响Th1/Th2功能平衡,即可促进Th2型反应而抑制Thl型反应；(2)在体内,ANP信号可促进肺局部Th2型应答,结合体外观察结果,这很可能是ANP信号加重过敏性哮喘气道炎症反应的机制之一。