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本研究以新孢子虫和弓形虫为研究对象，采用抑制差减杂交技术对新孢子虫和弓形虫差异表达基因进行分析，以期找到新孢子虫特异基因以建立其检测方法。首先采用SSH技术构建新孢子虫和弓形虫的差减文库，然后经生物信息学分析获得新孢子虫特异基因。结果表明从新孢子虫和弓形虫的差减文库获得新孢子虫特异基因74个。利用NCLIV004830、表面蛋白NcMIC6和通过分析新孢子虫基因组获得的NcP40共3个基因分别建立了新孢子虫特异检测方法并应用这些方法进行了新孢子虫病流行病学调查。用SSH技术筛选到的特异基因NCLIV004830部分片段为目标DNA，设计一对新孢子虫nested-PCR特异引物，建立新孢子虫特异nested-PCR检测方法并对反应条件进行优化。并用该方法对沈阳地区犬新孢子虫病进行了流行病学调查。结果表明，nested-PCR灵敏度明显高于常规PCR，可检测到1个虫体基因组DNA。该方法特异性强，与Hammondia heydorni、弓形虫、犬囊等孢球虫无交叉反应。可用于新孢子虫速殖子、包囊、卵囊阶段的检测。用本研究建立的nested-PCR进行沈阳地区犬新孢子虫流行病学调查，发现沈阳地区犬新孢子虫感染率为38%；ITS1序列系统发育分析显示沈阳地区犬新孢子虫有4个基因型。本研究从SSH文库中筛选到了新孢子虫表面蛋白NcMIC6，并通过分析新孢子虫基因组获得了NcP40表面蛋白，通过原核表达获得目的蛋白，并经试验分析这两个蛋白均不与弓形虫血清发生交叉反应，为新孢子虫特异性抗原，并在此基础上建立了新孢子虫间接ELISA检测方法，分别是NcP40-ELISA和NcMIC6-ELISA；并对这两种ELISA检测方法进行了条件优化，并确定了ELISA检测方法的特异性、灵敏度和重复性，结果表明这两种方法特异性好，灵敏度高，重复性好。应用NcP40-ELISA对长春地区草原黄牛新孢子虫血清学流行病学调查，结果表明长春地区草原黄牛新孢子虫感染率为16.5%，且随着黄牛年龄增加感染率下降。通过对长春地区人新孢子虫血清学流行病学调查，发现部分疑似阳性样本，经western-blot验证为阴性，并没有发现人血清新孢子虫抗体阳性结果。综上所述，本研究完成了新孢子虫与弓形虫SSH cDNA文库的构建并筛选到了新孢子虫病诊断的侯选基因，建立了特异的新孢子虫nested-PCR、NcP40-ELISA和NcMIC6-ELISA检测方法并进行了应用。建立的新孢子虫3种检测方法均可用于新孢子虫病诊断和流行病学调查。