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免疫分天然免疫与获得性免疫。天然免疫是机体在种系发育和进化过程中形成的天然免疫防御功能,即出生后就已具备的非特异性防御功能;适应性免疫指出生后通过与抗原物质接触所产生的一系列防御功能。鱼类免疫系统包括天然免疫和获得性免疫系统,是同时具有两种免疫系统的最低等的脊椎动物。鱼类免疫系统处于天然免疫和获得性免疫的进化的交汇点上,其中天然免疫对于鱼类抗病而言具有更重要的意义。干扰素(IFN)是鱼类及高等脊椎动物天然免疫系统的重要组成部分,为一类诱导表达的、具有抗病毒功能的细胞因子。根据干扰素受体及其结合受体后引起的宿主免疫反应,鱼类干扰素可以分为两类:Ⅰ型干扰素及Ⅱ型干扰素(又名IFN-γ)。鱼类Ⅰ型干扰素基因由5个外显子和4个内含子组成,其受体包含IFNAR1和IFNAR2两个亚单位。Ⅱ型干扰素基因具有四个外显子和三个内含子,其受体包含两个亚单位:IFN-γR1和IFN-γR2。本研究克隆了三倍体湘云鲫两个IFN基因的c DNA全长序列,并初步探讨了该两种IFN基因的功能。本论文的研究内容及结果如下:1.3n IFNa基因c DNA全长740bp,其中编码区长度为552 bp,5’UTR长度为52bp,3’UTR长度为136bp。3n IFNa基因c DNA预测可以编码183个氨基酸。通过Ex PASy分析3n IFNa氨基酸序列,其分子量为2169.1,理论等电点为9.35。2.3n IFNb基因c DNA全长715bp,其中编码区长度为552 bp,5’UTR的长度为52bp,3’UTR长度为111bp。3n IFNb基因c DNA预测可以编码183个氨基酸。通过Ex PASy分析3n IFNb基因的氨基酸序列,其分子量为2162.1,理论等电点为9.65。3.比较3n IFNa和3n IFNb氨基酸序列同源性发现:3n IFNa和3n IFNb同源性为72.1%。通过系统进化树分析发现,3n IFNa和3n IFNb与鲤科鱼类IFN亲缘关系较近,与哺乳动物的IFN亲缘关系较远。4.以pc DNA5-FRT/TO载体为基础构建表达3n IFNa的重组质粒:pc DNA5-FRT/TO-HA-3n IFNa和pc DNA5-FRT/TO-3n IFNa-HA。分别将这两种表达重组质粒通过磷酸钙转染法导入HEK293T细胞,Wester n blotting检测到3n IFNa基因能够在HEK293T细胞中正常表达,并且其蛋白分子大小在15~25KD之间。pc DNA5-FRT/TO-3n IFNa-HA转染导入HEK293T,其细胞上清液中能检测到3n IFNa,说明3n IFNa的蛋白是一种分泌蛋白。5.以pc DNA5-FRT/TO载体为基础构建表达3n IFNb的重组质粒:pc DNA5-FRT/TO-HA-3n IFNb和pc DNA5-FRT/TO-3n IFNb-HA,分别将这两种表达重组质粒通过磷酸钙转染法导入HEK293T细胞,Wester n blotting检测到三倍体鱼的IFNb基因能够在HEK293T细胞中正常表达,并且其蛋白分子大小在15~25KD之间。不管是pc DNA5-FRT/TO-HA-3n IFNb还是pc DNA5-FRT/TO-3n IFNb-HA,其表达蛋白均不能在HEK293T细胞上清液中被检测到,说明3n IFNb的蛋白是细胞内表达蛋白。6.分别将pc DNA5-FRT/TO-HA-3n IFNa或pc DNA5-FRT/TO-3n IFNaHA质粒通过磷酸钙转染法导入HEK293T细胞,采用PNGase F对其全细胞蛋白进行酶切,并结合Western blotting发现HA-3n IFNa有糖基化修饰,而3n IFNa-HA没有糖基化修饰。7.将pc DNA5-FRT/TO-3n IFNb-HA表达质粒通过磷酸钙转染法导入HEK293T细胞,采用PNGase F对其全细胞蛋白酶切,并结合Western blotting发现载体pc DNA5-FRT/TO-3n IFNb-HA表达蛋白有糖基化修饰,说明3n IFNb蛋白具有糖基化修饰。综上所述,本论文克隆了三倍体湘云鲫的两种IFN基因的c DNA,并对三倍体鱼的IFNa和IFNb基因的表达及蛋白糖基化修饰做了初步研究。本论文为将来系统研究IFN在三倍体鱼天然免疫抗病中的功能打下了基础。