【摘 要】
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源自基因组的突变可能会在转录和翻译后改变原蛋白的功能和性质,从而使得生物体发生性状改变,因此部分病原生物基因的碱基突变和缺失将影响疾病的诊断和治疗,如幽门螺杆菌23S r RNA基因中A2142C、A2142G、A2143G位点单碱基突变导致其克拉霉素耐药性产生,影响常规治疗方案的根除效果;而新型冠状病毒基因组中抗原蛋白表达基因的碱基置换和缺失会造成抗原识别位点发生变异,使其对抗体中和的敏感性降低
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源自基因组的突变可能会在转录和翻译后改变原蛋白的功能和性质,从而使得生物体发生性状改变,因此部分病原生物基因的碱基突变和缺失将影响疾病的诊断和治疗,如幽门螺杆菌23S r RNA基因中A2142C、A2142G、A2143G位点单碱基突变导致其克拉霉素耐药性产生,影响常规治疗方案的根除效果;而新型冠状病毒基因组中抗原蛋白表达基因的碱基置换和缺失会造成抗原识别位点发生变异,使其对抗体中和的敏感性降低,导致具有更高的感染率变异毒株的出现,增加其传播性,因此实现对病原生物基因中的碱基置换和缺失的快速灵敏检测对于疾病的防控和治疗具有重大意义。目前碱基突变和缺失的主要检测手段为下一代核酸测序(Next Generation Sequencing,NGS),但存在步骤繁琐、设备要求高、周期长等问题。本人所在课题组在前期工作中开发了一种窄变温核酸扩增技术,该技术仅需一台普通的荧光实时PCR仪,可以将扩增时间缩短至30分钟,而且结果实时报告。为了缩短检测时间、加快分析效率,本研究结合上述窄变温核酸扩增技术和序列特异扩增技术,开发出一种新型核酸快速扩增的检测方法——加速循环的聚合酶链式反应(Accelerated Cycling Polymerase Chain Reaction,AC-PCR)用于检测基因组碱基突变和缺失。该方法具有良好的灵敏度和特异性,对幽门螺杆菌A2143G和A2142G/C单碱基突变的检测限分别低至10和100拷贝/反应,并可以检测到样本中比例为0.1%的A2143G突变型核酸。此外,在新型冠状病毒Lambda和Delta变体的分型检测中,该方法对碱基缺失的刺突蛋白表达基因的检测限低至10拷贝/反应,通过模拟咽拭子样本检测结果显示该方法检测下限的十次重复分离系数为3.3%,验证了该方法的稳定性。基于上述加速循环的聚合酶链式反应,本研究建立了胃粘膜样本中耐克拉霉素幽门螺杆菌检测分析方法,可用于临床用药指导分析,减少抗生素耐药性导致的幽门螺杆菌根除失败,并建立了新型冠状病毒Lambda和Delta变体检测方法,有望用于发展中国家新型冠状病毒肺炎疫情的分析和防控。
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